C A N E L I B E R O N L I N E: Ebola Virus brevettato dal governo degli Stati Uniti nel mese di ottobre 2009: "un'invenzione relativa a nuove specie di Ebola (hEbola) virus umano" Global Research, 20 settembre 2014 Google (Brevetti)

Ebola Virus brevettato dal governo degli Stati Uniti nel mese di ottobre 2009: "un'invenzione relativa a nuove specie di Ebola (hEbola) virus umano"

Global Research, 20 settembre 2014

ebola microscopio virus globalresearch.ca

"La presente invenzione si basa su l'isolamento e l'identificazione di una nuova specie umana da virus Ebola, EboBun e il sequenziamento del unico altro conosciuto dell'Africa occidentale Ebola specie EboIC. EboBun è stato isolato da pazienti affetti da febbre emorragica in una recente epidemia in Uganda.

Il virus isolato è un membro della famiglia Filoviridae, una famiglia di virus a RNA senso negativo. Di conseguenza, l'invenzione riguarda l'EboBun isolato o virus EBOIC che morfologicamente e filogeneticamente riferisce a membri noti Filoviridae ".

Numero di pubblicazione	US20120251502 A1
Tipo di pubblicazione	Applicazione
Numero della domanda	US 13/125890
Numero PCT	PCT / US2009 / 062079
Data di pubblicazione	4 ottobre 2012
Data di deposito	26 ott 2009
Data di priorità	24 Ottobre 2008
Pubblicato anche come	CA2741523A1 , 4 Altro »
Inventori	Jonathan S. Towner , 4 Altro »
Assegnatario originale	Il governo degli Stati Uniti come rappresentato dal Segretario del Dipartimento di salute
Export Citation	BiBTeX , EndNote , RefMan
Citazioni di brevetti (2), Citazioni Non-brevetti (8), Classifiche (39), Eventi legali (1)

Collegamenti esterni: USPTO , assegnazioni USPTO , Espacenet

Umane Specie virus Ebola e Composizioni e Metodi Di cui

US 20120251502 A1

Astratto

Sono forniti Composizioni e metodi, tra cui e correlate al virus Ebola Bundibugyo (EboBun).Composizioni sono forniti che sono operabili come immunogeni per suscitare e risposta immunitaria o la protezione da EboBun sfida in un soggetto come un primate. Metodi inventivi sono dirette alla diagnosi e il trattamento delle infezioni EboBun.

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Reclami (30)

1 . Un isolato virus hEbola comprendente una molecola di acido nucleico comprendente una sequenza nucleotidica di:

a) una sequenza nucleotidica di cui in SEQ ID NOS: 1 o 10;

b) una sequenza nucleotidica ibridare in condizioni rigorose per SEQ ID NOS: 1 o 10; o

c) una sequenza nucleotidica di almeno il 70% -99% di identità alla SEQ ID NOS: 1 o 10, con la condizione che detta sequenza nucleotidica non è SEQ ID NO: 20.

2 . Un virus hEbola isolato avendo Centers for Disease Control Cassetta di adesione n ° 200.706.291.

3 . Il virus hEbola della rivendicazione 1, che viene ucciso.

4 . Il virus hEbola della rivendicazione 1, che è un virus hEbola attenuato.

5 . Il virus della rivendicazione 4 in cui almeno una proprietà del virus attenuato hEbola è diminuito tra infettività, la capacità di replica, capacità di sintesi proteica, assemblaggio abilità o effetto citopatico.

6 . Una molecola isolata di acido nucleico comprendente la sequenza nucleotidica di SEQ ID NOS: 1 o 10 o un complemento della stessa, o un suo frammento in cui detto frammento comprende una sequenza nucleotidica tra 4 e 4900 nucleotidi contigui della sequenza nucleotidica di SEQ ID NOS : 1 o 10, o un complemento della stessa; con la condizione che detta sequenza nucleotidica non è costituito dalla sequenza nucleotidica di cui in SEQ ID NO: 20; o tra 5500 e 6600 nucleotidi contigui della sequenza nucleotidica di SEQ ID NOS: 1 o 10, o un complemento della stessa.

7 . La molecola isolata di acido nucleico secondo la rivendicazione 6 comprendente una sequenza nucleotidica tra 4 e 4900 nucleotidi contigui della sequenza nucleotidica di SEQ ID NOS: 1 o 10, o un complemento della stessa; con la condizione che detta sequenza nucleotidica non è costituito dalla sequenza nucleotidica di cui in SEQ ID NO: 20; o tra 5500 e 6600 nucleotidi contigui della sequenza nucleotidica di SEQ ID NOS: 1 o 10, o un complemento della stessa.

8 . La molecola isolata di acido nucleico secondo la rivendicazione 7 comprendente una sequenza nucleotidica che codifica la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 2-9, 59, o SEQ ID NO: 11-19 o un complemento della stessa.

9 Un isolato l'RNA o DNA molecola di acido nucleico che si ibrida in condizioni stringenti ad una molecola di acido nucleico avente la sequenza nucleotidica di SEQ ID NOS:. 1 o 10 o un complemento della stessa.

10 . Un polipeptide isolato codificata dalla molecola di acido nucleico della rivendicazione 7.

11 . Il polipeptide secondo la rivendicazione 10 comprendente l'amminoacido di:

a) una sequenza amminoacidica stabilito in qualsiasi di SEQ ID NOS: 2-19, o 59; o

b) una sequenza amminoacidica che ha il 70% -99% di omologia di sequenza aminoacidica di (a).

12 . Il polipeptide secondo la rivendicazione 10 in cui la sequenza amminoacidica ha

5-250 residui contigui aminoacidi della sequenza aminoacidica di SEQ ID NOS: 5 o 18 (VP24);

5-280 residui contigui della sequenza amminoacidica di SEQ ID NOS: 6 o 17 (VP30);

5-320 residui contigui della sequenza amminoacidica di SEQ ID NOS: 8 o 13 (VP40);

5-340 residui contigui della sequenza amminoacidica di SEQ ID NOS: 7 o 12 (VP35);

5-370 residui contigui della sequenza amminoacidica di SEQ ID NOS: 4 o 15 (PSC);

5-370 residui contigui della sequenza amminoacidica di SEQ ID NOS: 59 o 16 (SSGP);

5-670 residui contigui della sequenza amminoacidica di SEQ ID NOS: 9 o 14 (GP);

5-730 residui contigui della sequenza amminoacidica di SEQ ID NOS: 3 o 11 (NP); o

5-2200 residui contigui della sequenza amminoacidica di SEQ ID NOS: 2 o 19 (L).

13 . (annullato)

14 . (annullato)

15 . (annullato)

16 . (annullato)

17 . (annullato)

18 . (annullato)

19 . (annullato)

20 . Il virus hEbola delle rivendicazioni 3 o 4, o un estratto di proteina da esso, e un veicolo farmaceuticamente accettabile.

21 . (annullato)

22 . La molecola di acido nucleico delle rivendicazioni 6 o 9, e un veicolo farmaceuticamente accettabile.

23 . (annullato)

24 . (annullato)

25 . (annullato)

26 . (annullato)

27 . (annullato)

28 . (annullato)

29 . (annullato)

30 . (annullato)

Descrizione

APPLICAZIONI CORRELATE

Questo beneficio priorità richieste applicative degli Stati Uniti Applicazione provvisoria 61/108175 depositata 24 Ottobre 2008; i cui contenuti sono qui incorporati per riferimento.

DEPOSITO DICHIARAZIONE

L'invenzione fornisce gli isolati di Ebola (hEbola) virus umani denotati come Bundibugyo (EboBun) depositati presso i Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie ("CDC";. Atlanta, GA, Stati Uniti d'America) il 26 novembre 2007 e concesso un numero di accesso 200706291. Questo deposito non è stato fatto a un depositario internazionale Authority (IDA), come stabilito ai sensi del trattato di Budapest sul riconoscimento internazionale del deposito di microorganismi agli effetti della procedura brevettuale, ed è un deposito trattato di non-Budapest.L'organismo depositato non è accettabile dalla American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia. Autorità internazionale di deposito (IDA), come stabilito ai sensi del trattato di Budapest sul riconoscimento internazionale del deposito di microorganismi agli effetti della procedura brevettuale,. Campioni del detto deposito adesione No. 200706291 saranno messi a disposizione impianti autorizzati per trenta anni dalla data del deposito, e per tutta la durata del brevetto di emissione da, o rivendicazione di priorità a questa applicazione.

CAMPO DELL'INVENZIONE

L'invenzione si riferisce a composizioni e metodi diretti a una nuova specie di Ebola (hEbola) virus umano.

STATO DELLA

La famiglia Filoviridae consiste di due generi, Marburgvirus e Ebolavirus, che si sono probabilmente evoluti da un antenato comune 1 . Il genere Ebolavirus comprende quattro specie: Zaire, Sudan, Reston e Costa d'Avorio (Costa d'Avorio) ebolaviruses, che hanno, ad eccezione di Reston e Costa d'Avorio ebolaviruses, stato associato con una grande febbre emorragica (HF) epidemie in Africa con elevata letalità (53-90%) 2 .

I virus di ogni specie hanno genomi che sono almeno il 30-40% divergenti l'una dall'altra, un livello di diversità che riflette presumibilmente differenze nella nicchia ecologica occupano nonché della loro storia evolutiva. Identificazione della riserva naturale di ebolaviruses rimane un po 'sfuggente, anche se recenti dati PCR e anticorpi suggeriscono che tre specie di pipistrelli della frutta arboree possono essere portatori di Zaire ebolavirus 3 . Nessun dato è stato ancora pubblicato per suggerire serbatoi per il Sudan, Reston e Costa d'Avorio specie Ebolavirus.Tuttavia, un frutto bat-caverna dimora è stata recentemente implicata come un ospite naturale per Marburgvirus 4, 5 , sostenendo l'ipotesi che diverse specie di pipistrelli possono essere i padroni di casa serbatoio per i vari filovirus.

Focolai Filovirus sono sporadici, a volte intervallati da anni o addirittura decenni di attività di malattia apparente. Le ultime nuove specie di ebolavirus è stata scoperta 14 anni fa (1994), in Costa d'Avorio (Costa d'Avorio), e ha coinvolto un singolo caso non fatale, un veterinario che ha eseguito l'autopsia su uno scimpanzé infetto trovato nella foresta di Tai 6 . Senza ulteriori relazioni di malattia sono stati associati con la Costa d'Avorio ebolavirus, a differenza di Zaire e Sudan ebolaviruses che hanno ciascuno ha causato più grandi epidemie nello stesso periodo di tempo.

Alla fine di novembre del 2007, sono stati segnalati casi di scompenso cardiaco nei comuni di Bundibugyo e Kikyo in Bundibugyo District, Western Uganda. L'epidemia ha continuato fino a gennaio del 2008, e ha portato in circa 149 casi e 37 morti 2 . Indagini di laboratorio dei primi 29 casi di sospetto-campioni di sangue con metodi classici (antigene-capture, IgM e IgG ELISA) e un approccio pyrosequencing casuale innescato sviluppata di recente identificato questo per essere un focolaio di Ebola HF associato a una nuova specie Ebolavirus scoperte. Questi campioni sono risultati negativi quando inizialmente analizzati con alta sensibilità real-time RT-PCR test specifici per tutti i noti Zaire e Sudan ebolaviruses e virus Marburg. Questa nuova specie è qui definito "la specie Bundibugyo", abbreviato "EboBun".

Di conseguenza, composizioni e metodi diretti alle nuove specie di virus Ebola sono descritte nel presente documento e più strettamente connesse specie Ebola Costa d'Avorio, che composizioni e metodi sono utili per la diagnosi e la prevenzione di infezione da virus Ebola umana; compreso lo sviluppo di vaccini relativi, e la prevenzione della febbre emorragica in una popolazione umana.

ESPOSIZIONE DEL TROVATO

La presente invenzione si basa su l'isolamento e l'identificazione di una nuova specie di virus Ebola umana, EboBun. EboBun è stato isolato da pazienti affetti da febbre emorragica in una recente epidemia in Uganda. Il virus isolato è un membro della famiglia Filoviridae, una famiglia di virus a RNA senso negativo. Di conseguenza, l'invenzione riguarda il virus EboBun isolata che morfologicamente e filogeneticamente riferisce ai membri noti Filoviridae.

In un aspetto, l'invenzione fornisce il virus EboBun isolato depositati presso i Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie ("CDC", Atlanta, GA, Stati Uniti d'America.) Il 26 novembre 2007 e concesso un numero di accesso 200.706.291, come indicato nel paragrafo intitolato "supra DEPOSITO affermazione".

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un isolato del virus hEbola EboBun comprendente una molecola di acido nucleico comprendente una sequenza nucleotidica scelta nel gruppo costituito da: a) una sequenza nucleotidica di cui in SEQ ID NO: 1; b) una sequenza nucleotidica che si ibrida alla sequenza di cui in SEQ ID NO: 1 in condizioni rigorose; c) una sequenza nucleotidica che ha almeno il 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% di identità di SEQ ID NO: 1 un altro aspetto, l'invenzione fornisce la sequenza genomica completa del virus EboBun hEbola.

In un aspetto correlato, l'invenzione fornisce molecole di acido nucleico isolate da EboBun, o loro frammenti.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce proteine o polipeptidi che sono isolate dal EboBun, incluse proteine virali isolati da cellule infettate con il virus ma non presente nelle cellule non infettate comparabili; o loro frammenti. In una forma di realizzazione della presente invenzione, le sequenze amminoacidiche delle proteine o polipeptidi sono definite nelle SEQ ID NOS: 2-9 e 59, o loro frammenti.

In un aspetto correlato, l'invenzione fornisce un polipeptide isolato codificato dalla molecola di acido nucleico del hEbola EboIC (Sequenza ID No. 10) virus inventivo sopra descritto.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un isolato del virus hEbola EboIC comprendente una molecola di acido nucleico comprendente una sequenza nucleotidica scelta nel gruppo costituito da: a) una sequenza nucleotidica di cui in SEQ ID NO: 10; b) una sequenza nucleotidica che si ibrida alla sequenza di cui in SEQ ID NO: 10 in condizioni rigorose; c) una sequenza nucleotidica che ha almeno il 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% di identità di SEQ ID NO: 10 In un altro aspetto, l'invenzione fornisce la sequenza genomica completa del virus hEbola EboIC.

In un aspetto correlato, l'invenzione fornisce molecole di acido nucleico isolate da EboIC, o loro frammenti.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce proteine o polipeptidi che sono isolate dal EboIC, incluse proteine virali isolati da cellule infettate con il virus ma non presente nelle cellule non infettate comparabili; o loro frammenti. In una forma di realizzazione della presente invenzione, le sequenze amminoacidiche delle proteine o polipeptidi sono definite nelle SEQ ID NOs: 11-19, o loro frammenti.

In un aspetto correlato, l'invenzione fornisce un polipeptide isolato codificato dalla molecola di acido nucleico del virus inventivo hEbola EboIC descritto sopra.

In altri aspetti, l'invenzione riguarda l'uso del virus isolato hEbola per metodi diagnostici e terapeutici basati su EbBun, EboIC, o una loro combinazione. In una forma di realizzazione, l'invenzione fornisce un metodo di rilevazione in un campione biologico immunospecifica un anticorpo per il genere di Occidente Afrin Ebola specie che costituiscono hEbola EbBun e EboIC virus utilizzando almeno un isolato virus hEbola inventiva qui descritto, o una qualsiasi delle proteine inventive o polipeptidi come descritto nel presente documento. In un'altra forma di realizzazione specifica, l'invenzione fornisce un metodo di screening per un anticorpo che si lega e neutralizza immunospecifically hEbola EboBun. Tale anticorpo è utile per una immunizzazione passiva o immunoterapia di un soggetto infettato con hEbola.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un anticorpo isolato o un frammento antigene vincolante degli stessi che si lega immunospecifically al virus hEbola dell'invenzione sopra descritta.

In altri aspetti, l'invenzione fornisce metodi per rilevare la presenza, l'attività o l'espressione del Glade di Bundibungyo-Ivory Coast hEbola virus in un materiale biologico, come le cellule, sangue, saliva, urina, feci e così via; ed in particolare almeno uno di EbBun o EboIC.

In un aspetto correlato, l'invenzione fornisce un metodo per rilevare la presenza del virus hEbola inventivo sopra descritto in un campione biologico, il metodo comprende (a) contattare il campione con un agente che si lega selettivamente ad un virus occidentale hEbola; e (b) rilevare se il composto si lega al virus occidentale hEbola nel campione.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un metodo per rilevare la presenza del polipeptide inventivo sopra descritto, in un campione biologico, detto metodo include (a) contattare il campione biologico con un agente che si lega selettivamente al polipeptide; e (b) rilevare se l'agente si lega al polipeptide nel campione. In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un metodo per rilevare la presenza di una prima molecola di acido nucleico derivante dal virus hEbola inventivo sopra descritto in un campione biologico, il metodo comprendendo: (a) mettere a contatto il campione biologico con un agente che si lega selettivamente al il polipeptide; e (b) rilevare se l'agente si lega al polipeptide nel campione.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un metodo per la propagazione del virus hEbola in cellule ospiti comprendenti infettare le cellule ospiti con il virus isolato hEbola inventivo sopra descritto, coltivando le cellule ospiti per consentire al virus di moltiplicarsi, e raccogliere i virioni risultanti.Anche fornito dalla presente invenzione sono cellule ospiti infettate con il virus hEbola inventivo descritto sopra.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un metodo per rilevare, in un campione biologico la presenza di un anticorpo che si lega immunospecifically virus hEbola, il metodo comprendendo: (a) mettere a contatto il campione biologico con l'host cellula ospite inventivo sopra descritto; e (b) rilevare l'anticorpo legato alla cella.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce preparazioni di vaccino, comprendente il virus hEbola inventivo, comprese le forme ricombinanti e chimeriche del virus, molecole di acido nucleico compresi dal virus o subunità proteiche del virus. L'invenzione fornisce inoltre una formulazione di vaccino comprendente una quantità terapeuticamente efficace o profilassi del virus hEbola inventivo sopra descritto, e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In una forma di realizzazione, l'invenzione fornisce una formulazione di vaccino comprendente una quantità terapeuticamente o profilatticamente efficace di un estratto proteico del virus inventivo hEbola descritto sopra, o una subunità della stessa; e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In un altro, l'invenzione fornisce una formulazione di vaccino comprendente una quantità terapeuticamente efficace o profilassi di una molecola di acido nucleico comprendente la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO: 1 o un complemento della stessa, e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In un altro, l'invenzione fornisce una formulazione di vaccino comprendente una quantità terapeuticamente efficace o profilassi di una molecola di acido nucleico comprendente una delle sequenze nucleotidiche inventivi come descritto sopra, o un complemento della stessa, e un veicolo farmaceuticamente accettabile.

In un aspetto correlato, l'invenzione fornisce una formulazione immunogenica comprendente una quantità efficace immunogenically del virus hEbola inventivo sopra descritto, e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In un altro aspetto correlato, l'invenzione fornisce una formulazione immunogenica comprendente una quantità efficace di un immunogenically estratto proteico del virus hEbola inventivo descritto sopra o una subunità della stessa, e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In un altro aspetto correlato, l'invenzione fornisce una formulazione immunogenica comprendente una quantità immunogenically efficace di una molecola di acido nucleico comprendente la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO: 1 o un complemento della stessa, e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In un altro aspetto correlato, l'invenzione fornisce una formulazione immunogenica comprendente una quantità immunogenically efficace di una molecola di acido nucleico comprendente la sequenza nucleotidica inventiva come descritto sopra o un complemento della stessa, e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In un altro aspetto correlato, l'invenzione fornisce una formulazione immunogenica comprendente una quantità immunogenically efficace di qualsiasi dei polipeptidi inventivi sopra descritti.

In un altro aspetto, la presente invenzione fornisce composizioni farmaceutiche comprendenti agenti antivirali della presente invenzione e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In una forma di realizzazione specifica, l'agente antivirale dell'invenzione è un anticorpo che si lega immunospecifically virus hEbola o qualsiasi epitopo hEbola. In un'altra forma di realizzazione specifica, l'agente antivirale è un polipeptide o proteina della presente invenzione o molecola di acido nucleico dell'invenzione.

L'invenzione fornisce anche kit contenenti composizioni e formulazioni della presente invenzione.Così, in un altro aspetto, l'invenzione fornisce un kit comprendente un contenitore contenente la formulazione immunogenico inventivo sopra descritto. In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un kit comprendente un contenitore contenente la formulazione del vaccino inventivo sopra descritto.In un altro, l'invenzione fornisce un kit comprendente un contenitore contenente la composizione farmaceutica inventivo sopra descritto. In un altro, l'invenzione fornisce un kit comprendente un contenitore contenente la formulazione del vaccino inventivo sopra descritto. In un altro, l'invenzione fornisce un metodo per identificare un soggetto infettato con il virus hEbola inventivo sopra descritto, comprendente: (a) ottenere RNA totale da un campione biologico ottenuto dal soggetto; (B) operazioni di trascrivere l'RNA totale per ottenere cDNA; e (c) amplificare il cDNA utilizzando un set di primer derivati da una sequenza nucleotidica del virus hEbola inventivo sopra descritto.

L'invenzione riguarda inoltre l'uso delle informazioni di sequenza del virus isolato per metodi diagnostici e terapeutici.

In un altro aspetto, la presente invenzione fornisce metodi di screening per agenti antivirali che inibiscono l'infettività e la replicazione del virus hEbola o varianti della stessa.

L'invenzione fornisce inoltre metodi di preparazione di forme ricombinanti o chimeriche di hEbola.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI

Fico. 1 rappresenta un albero filogenetico confrontando i genomi full-length di Ebolavirus e Marburg virus mediante analisi bayesiana;

Fico. 2 rappresenta un allineamento dei genomi del romanzo hEbola EboBun (SEQ ID NO: 1) di cui di seguito come "Ebola Bundibugyo" o "EboBun", e hEbola Zaire (SEQ ID NO: 20); di seguito definito "Ebola Zaire '76" o "EboZ" e hEbola Costa d'Avorio (SEQ ID NO: 10) di cui anche sotto come "EboIC".

DESCRIZIONE DEL PREFERITE FORME

E 'da intendersi che la presente invenzione non è limitata alle particolari forme di realizzazione descritte, come tali possono, ovviamente, variare. E 'anche da intendersi che la terminologia utilizzata nel presente documento ha lo scopo di descrivere solo particolari realizzazioni, e non è destinato ad essere limitante.

A causa della divergenza sequenza di EboBun relativi a tutti ebolaviruses precedentemente riconosciuti, la presente invenzione ha utilità nella progettazione di test diagnostici per il monitoraggio della malattia Ebola HF nell'uomo e negli animali, e sviluppare farmaci antivirali e vaccini efficaci.

Il virus EboBun della presente invenzione è geneticamente distinto, che differiscono di oltre il 30% a livello di genoma da tutte le altre specie Ebolavirus noti. La natura unica di questo virus creato sfide per Filovirus tradizionale test molecolari diagnostici e approcci basati su sequenziamento del genoma. Invece, oltre il 70% del genoma del virus è stato sequenziato utilizzando un approccio pyrosequencing casuale innescato recentemente sviluppato che ha permesso il rapido sviluppo di test di rilevazione molecolare, che sono stati schierati nella risposta focolaio di malattia. Questo progetto pyrosequencing casuale innescato sequenza ha permesso un più rapido completamento di tutta la sequenza del genoma utilizzando tradizionale approccio di primer walking e la conferma che il virus EboBun rappresentato una nuova specie Ebolavirus.

Definizioni

Le definizioni qui forniti sono operativi in tutta la descrizione dell'invenzione qui indicate, compreso il Sommario dell'invenzione.

Il termine "un anticorpo o un frammento di anticorpo che si lega immunospecifically un polipeptide dell'invenzione", come qui utilizzato si riferisce ad un anticorpo o un suo frammento che lega immunospecifically al polipeptide codificato dalla sequenza nucleotidica di SEQ ID NO: 1 (EboBun), o un suo frammento, e non non specificatamente legarsi ad altri polipeptidi. Un anticorpo o un suo frammento che lega immunospecifically al polipeptide dell'invenzione può intersecare-reagire con altri antigeni. Preferibilmente, un anticorpo o un suo frammento che lega immunospecifically ad un polipeptide dell'invenzione non reattività crociata con altri antigeni. Un anticorpo o un suo frammento che lega immunospecifically al polipeptide dell'invenzione possono essere identificati, ad esempio, saggi immunologici o altre tecniche note agli esperti del ramo, o altrimenti come qui descritto.

Un "isolata" o "purificato" peptide o proteina è sostanzialmente privo di materiale cellulare o di altre proteine contaminanti dalla fonte di cellule o di tessuti da cui la proteina è derivato, o sostanzialmente esente da precursori chimici o altri prodotti chimici quando sintetizzata chimicamente. Il linguaggio "sostanzialmente privo di materiale cellulare" comprende preparazioni del polipeptide / proteina in cui il polipeptide / proteina è separato dai componenti cellulari delle cellule da cui è isolato o ricombinante prodotta. Così, un polipeptide / proteina che è sostanzialmente privo di materiale cellulare comprende le preparazioni del polipeptide / proteina avente meno di circa il 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5% o 1% (in peso secco) di proteine contaminanti .Quando il polipeptide / proteina ricombinante è prodotta, è anche preferibilmente sostanzialmente privo di mezzo di coltura, cioè, un terreno di coltura rappresenta meno del 20%, 10%, o 5% del volume del preparato proteina.

Quando polipeptide / proteina è prodotta mediante sintesi chimica, è preferibilmente sostanzialmente priva di precursori chimici o altre sostanze chimiche, cioè, è separato da precursori chimici o altre sostanze chimiche che sono coinvolti nella sintesi della proteina. Di conseguenza, tali preparazioni del polipeptide / proteine hanno meno di circa il 30%, 20%, 10%, 5% (in peso secco) di precursori chimici o composti diversi frammento polipeptidico / proteina di interesse. In una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, polipeptidi / proteine sono isolati o purificati.

Un "isolata" molecola di acido nucleico è uno che è separata da altre molecole di acido nucleico che sono presenti nella fonte naturale della molecola di acido nucleico. Inoltre, un "isolata" molecola di acido nucleico, come una molecola di cDNA, può essere sostanzialmente priva di altro materiale cellulare, o mezzo di coltura quando prodotta mediante tecniche ricombinanti, o sostanzialmente esente da precursori chimici o altri prodotti chimici quando sintetizzata chimicamente. In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, le molecole di acido nucleico che codificano polipeptidi / proteine dell'invenzione sono isolati o purificati. Il termine "isolato" molecola di acido nucleico non include un acido nucleico che è membro di una libreria che non è stato purificato da altri cloni di libreria contenenti altre molecole di acido nucleico.

Il termine "parte" o "frammento" qui utilizzato include le lunghezze specificate frammento, e tutti i numeri interi in mezzo, comprensivi dei punti finali specificati in un intervallo specificato, e comprensive di qualsiasi lunghezza fino a tutta la lunghezza di una proteina, polipeptide , o acido nucleico.

Il termine "avente un'attività biologica della proteina" o "aventi attività biologica dei polipeptidi dell'invenzione" si riferisce alle caratteristiche dei polipeptidi o proteine aventi attività biologica comune, dominio strutturale simili o identici, e / o aventi ammino sufficiente identità acido al polipeptide codificato dalla sequenza nucleotidica di SEQ ID NO: 1 (EboBun). Tali attività biologiche comuni dei polipeptidi dell'invenzione includono antigenicità e immunogenicità.

Il termine "sotto condizioni stringenti" si riferisce a condizioni di ibridazione e lavaggio in base ai quali sequenze nucleotidiche aventi almeno il 70%, almeno il 75%, almeno il 80%, almeno l'85%, almeno il 90%, o almeno 95% di identità di vicenda rimangono ibridati tra loro. Tali condizioni di ibridazione sono descritti in, per esempio, ma non limitati a, i protocolli attuali in Biologia Molecolare, John Wiley & Sons, New York (1989), 6.3.1-6.3.6; Metodi di base in Biologia Molecolare, Elsevier Science Publishing Co., Inc., NY (1986), pp 75-78, e 84-87.; e Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982), pp. 387-389, e sono ben noti agli esperti del ramo. Un preferito, ma non limitativo, delle condizioni di ibridazione stringenti è ibridazione in 6 × cloruro di sodio / citrato di sodio (SSC), 0,5% SDS a circa 68 ° C seguita da uno o più lavaggi in 2 x SSC, 0,5% SDS a camera temperatura. Un altro preferito, ma non limitativo, delle condizioni di ibridazione stringenti è ibridazione in 6 × SSC a circa 45 ° C, seguita da uno o più lavaggi in 0,2 x SSC, 0,1% SDS a circa 50-65 ° C.

Il termine "variante", come qui utilizzato si riferisce a un mutante genetico naturale di hEbola EboBun, o hEbola EboIC, o una variazione ricombinante preparato di queste specie hEbola, ciascuno dei quali contiene una o più mutazioni nel suo genoma rispetto al hEbola di SEQ ID NO: 1 o 10 Il termine "variante" può anche riferirsi ad una variazione naturale di un dato peptide o una variazione ricombinante preparato di un dato peptide o proteina in cui uno o più residui amminoacidici sono stati modificati da ammino sostituzione di acido, inoltre, o la cancellazione.

"Omologia" si riferisce alla sequenza di somiglianza o, in alternativa, identità di sequenza tra due o più sequenze polinucleotidiche o due o più sequenze polipeptidiche.

I termini "cento di identità" e "% di identità," applicato alle sequenze polinucleotidiche, si riferiscono alla percentuale di nucleotidica identica partite tra almeno due sequenze polinucleotidiche allineate utilizzando un algoritmo standardizzato. Un tale algoritmo può inserire, in modo standardizzato e riproducibile, lacune nelle sequenze confrontate al fine di ottimizzare l'allineamento tra due sequenze, e quindi ottenere un confronto più significativa delle due sequenze.

Identità percentuale tra sequenze polinucleotidiche può essere determinata mediante uno o più algoritmi o programmi noti nell'arte o in esso descritti informatici. Ad esempio, cento identità può essere determinato utilizzando i parametri di default dell'algoritmo CLUSTAL V come incorporata nel programma di allineamento di sequenze 3.12e versione MEGALIGN. Questo programma fa parte del pacchetto software Lasergene, una suite di programmi di analisi molecolari biologici (DNASTAR, Madison, Wis.). CLUSTAL V è descritto in Higgins, DG e PM Sharp (1989; CABIOS 5: 151-153) e in Higgins, DG et al. (1992; CABIOS 8: 189-191). Per allineamenti a coppie di sequenze polinucleotidiche, i parametri di default sono impostati come segue: Ktuple = 2, gap penalty = 5, finestre = 4, e "diagonali salvato" = 4. La tabella peso residuo "ponderato" è selezionato come predefinito.

In alternativa, una suite di uso comune e liberamente disponibili algoritmi di confronto sequenza che possono essere utilizzati sono fornite dal National Center for Biotechnology Information (NCBI) locale Allineamento base della Search Tool (BLAST) (Altschul, SF et al. (1990) J. Mol . Biol 215:. 403-410), che è disponibile da diverse fonti, tra cui il NCBI, Bethesda, Md, e sul sito Web di NCBI mondiale disponibili su Internet.. La suite software BLAST include vari programmi di analisi di sequenza tra cui "BLASTN", che viene utilizzato per allineare una sequenza di polinucleotide noto con altre sequenze polinucleotidiche da una varietà di basi di dati. È disponibile anche un tool chiamato "Blast 2 Sequenze" che viene utilizzato per il confronto a coppie diretta di due sequenze nucleotidiche. "Blast 2 sequenze" è possibile accedere e utilizzare in modo interattivo su Internet tramite il sito Web NCBI mondo pure. Lo strumento "BLAST 2 Sequenze" può essere utilizzato sia per BLASTN e BLASTP (discusso sotto). Programmi BLAST sono comunemente usati con spacco e altri parametri impostati ai valori predefiniti. Ad esempio, per confrontare due sequenze nucleotidiche, si può usare BLASTN con il "BLAST 2 Sequenze" strumento versione 2.0.12 (21 aprile 2000) fissato a parametri di default. Tali parametri di default possono essere, per esempio: Matrix: BLOSUM62; Ricompensa per partita: 1; Penali per mancata corrispondenza: -2; Aperto Gap: 5 ed estensione Gap: 2 penalità; Gap × drop-off: 50;Aspettatevi: 10; Word Dimensione: 11; Filtro: on.

Percentuale di identità può essere misurata sulla lunghezza di un'intera sequenza definita, per esempio, come definito da un particolare numero SEQ ID, o può essere misurata su una lunghezza inferiore, per esempio, sulla lunghezza di un frammento tratto da una più grande, definito sequenza, per esempio, un frammento di almeno 20, almeno 30, almeno 40, almeno 50, almeno 70, almeno 100, o almeno 200 nucleotidi contigui. Tali lunghezze sono esemplari soltanto, e si capisce che qualsiasi lunghezza frammento sostenuta dalle sequenze mostrate, in tabelle, figure, o elenco di sequenze, possono essere usati per descrivere una lunghezza sul quale percentuale d'identità può essere misurata.

Le frasi "cento di identità" e "% di identità", applicato a sequenze polipeptidiche, si riferiscono alla percentuale di partite di residui identici tra almeno due sequenze polipeptidiche allineate utilizzando un algoritmo standardizzato. Metodi di allineamento di sequenza polipeptidica sono ben noti. Alcuni metodi di allineamento tengono conto dei conservatori sostituzioni aminoacidiche.Tali sostituzioni conservative, spiegate in dettaglio in precedenza, generalmente preservare la carica e idrofobicità presso il sito della sostituzione, preservando in tal modo la struttura (e quindi la funzione) del polipeptide. Le frasi "cento somiglianza" e "% di somiglianza", applicato a sequenze polipeptidiche, si riferiscono alla percentuale di partite di residui, comprese le partite di residui identici e sostituzioni conservative, tra almeno due sequenze polipeptidiche allineate utilizzando un algoritmo standardizzato. Al contrario, sostituzioni conservative non sono inclusi nel calcolo della percentuale di identità tra le sequenze polipeptidiche.

Percentuale identità tra le sequenze polipeptidiche può essere determinato utilizzando i parametri di default dell'algoritmo CLUSTAL V come incorporata nel programma di allineamento di sequenze 3.12e versione MEGALIGN (descritta e di cui sopra). Per allineamenti a coppie di sequenze polipeptidiche utilizzando CLUSTAL V, i parametri di default sono impostati come segue: Ktuple = 1, gap penalty = 3, finestre = 5, e "diagonali salvato" = 5. La matrice PAM250 è selezionato come la tabella predefinita peso del residuo.

In alternativa, può essere utilizzata la suite software BLAST NCBI. Ad esempio, per un confronto a coppie di due sequenze polipeptidiche, si può usare il "BLAST 2 Sequenze" strumento versione 2.0.12 (21 Aprile 2000) con set BLASTP a parametri di default. Tali parametri di default possono essere, per esempio: Matrix: BLOSUM62; Aperto Gap: 11 e di estensione Gap: 1 penalità; Gap × drop-off: 50; Aspettatevi: 10; Word Dimensione: 3; Filtro: on.

Percentuale di identità può essere misurata sulla lunghezza di un'intera sequenza polipeptidica definito, ad esempio, come definito da un particolare numero SEQ ID, o può essere misurata su una lunghezza inferiore, per esempio, sulla lunghezza di un frammento tratto da una più grande, sequenza polipeptidica definita, ad esempio, un frammento di almeno 15, almeno 20, almeno 30, almeno 40, almeno 50, almeno 70 o almeno 150 residui contigui. Tali lunghezze sono esemplari soltanto, e si capisce che qualsiasi lunghezza frammento sostenuta dalle sequenze mostrate, in tabelle, figure o sequenza di profilo, possono essere usati per descrivere una lunghezza sul quale percentuale d'identità può essere misurata.

Il termine "agente" comprende qualsiasi sostanza chimica, biochimica, o molecola biologica;come piccole molecole, proteine, polipeptidi, anticorpi, molecole di acido nucleico, compreso DNA o RNA, e simili.

Metodi e Composizioni correlati alla inventiva hEbola

La presente invenzione si basa su l'isolamento e l'identificazione di una nuova specie umana da virus Ebola, EboBun e il sequenziamento del unico altro conosciuto dell'Africa occidentale Ebola specie EboIC. EboBun è stato isolato da pazienti affetti da febbre emorragica in una recente epidemia in Uganda. Il virus isolato è un membro della famiglia Filoviridae, una famiglia di virus a RNA senso negativo. Di conseguenza, l'invenzione riguarda l'EboBun isolato o virus EBOIC che morfologicamente e filogeneticamente riferisce ai membri noti Filoviridae.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un virus hEbola isolato compresa una molecola di acido nucleico con una sequenza nucleotidica che è preferibilmente: a) una sequenza nucleotidica di cui in SEQ ID NO: 1; b) una sequenza nucleotidica che si ibrida alla sequenza di cui in SEQ ID NO: 1 in condizioni rigorose; o c) una sequenza nucleotidica che ha almeno il 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o il 99% di identità al SEQ ID NO: 1 una forma di realizzazione della presente invenzione, il virus hEbola viene ucciso. In un altro, il virus è attenuato. In un altro, l'infettività del virus attenuato hEbola è ridotta. In un altro, l'infettività è ridotta di almeno 5 volte, 10 volte, 25 volte, 50 volte, 100 volte, 250 volte, 500 volte, o 10.000 volte. In un altro, la capacità di replicazione del virus attenuato hEbola è ridotta. In un altro, la capacità di replicazione del virus attenuato è educed da almeno 5 volte, 10 volte, 25 volte, 50 volte, 100 volte, 250 volte, 500 volte, 1000 volte, o 10,000- piega. In un altro, la capacità di sintesi proteica del virus attenuato viene ridotta. In un altro, la capacità di sintesi proteica è ridotta di almeno 5 volte, 10 volte, 25 volte, 50 volte, 100 volte, 250 volte, 500 volte, 1000 volte, o 10.000 volte. In un altro, la capacità di assemblaggio del virus attenuato hEbola è ridotta. In un altro, la capacità di assemblaggio del virus attenuato viene ridotta di almeno 5 volte, 10 volte, 25 volte, 50 volte, 100 volte, 250 volte, 500 volte, 1000 volte, o 10,000- piega. In un altro, l'effetto citopatico del virus attenuato hEbola è ridotta. In un altro, l'effetto citopatico è ridotta di almeno 5 volte, 10 volte, 25 volte, 50 volte, 100 volte, 250 volte, 500 volte, 1000 volte, o 10.000 volte.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce la sequenza genomica completa del virus hEbola EboBun o EboIC. In una forma di realizzazione specifica, il virus comprende una sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10, rispettivamente.

In un aspetto correlato, l'invenzione fornisce molecole di acido nucleico isolate da EboBun, EboIC, o loro frammenti. In una forma di realizzazione della presente invenzione, la molecola isolata di acido nucleico comprende la sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10, o un complemento della stessa. In un altro, la molecola di acido nucleico comprende una sequenza nucleotidica avente almeno 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 4600, 4700, 4800, o 4900 nucleotidi contigui della sequenza nucleotidica di SEQ ID NO: 1, o di un complemento di queste materie; con la condizione che la sequenza nucleotidica non è costituito dalla sequenza nucleotidica di cui in SEQ ID NO: 20 (sequenza nucleotidica Ebola Zaire); o almeno 5000, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, o 6600 nucleotidi contigui della sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10, o un complemento della stessa. In un'altra forma di realizzazione, la molecola isolata di acido nucleico comprende una sequenza nucleotidica che codifica la sequenza amminoacidica di SEQ ID EboBun Nn 2-9 o 59, la sequenza EboIC amminoacidica di SEQ ID NOs: 11-19, o un complemento della sequenza nucleotidica che codifica le sequenze di amminoacidi EboBun di SEQ ID Nn 2-9 o 59 o le sequenze di amminoacidi EboIC di SEQ ID Nn 11-19. In un altro, la molecola isolata di acido nucleico si ibrida in condizioni stringenti ad una molecola di acido nucleico avente la sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10 o un complemento della stessa, in cui la molecola di acido nucleico codifica una sequenza aminoacidica che ha una attività biologica esposto da un polipeptide codificato dalla sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10 In un'altra molecola di acido nucleico è RNA. In un altro, molecola di acido nucleico è il DNA.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce proteine o polipeptidi che sono isolate dal EboBun, comprendenti le proteine virali isolate da cellule infettate con il virus ma non presenti in cellule non infettate comparabili. In una forma di realizzazione della presente invenzione, le sequenze amminoacidiche delle proteine o polipeptidi sono definite nelle SEQ ID NOs: 2-9, 59, o 11-19, o loro frammenti. In una forma di realizzazione, polipeptidi o proteine della presente invenzione hanno una attività biologica della proteina (compresi antigenicità e / o immunogenicità) codificato dalla sequenza di SEQ ID NOs: 1 o 10 In un altro, polipeptidi o proteine della presente invenzione hanno una attività biologica di almeno una proteina avente la sequenza aminoacidica (compresi antigenicità e / o immunogenicità) previsto in SEQ ID NOS: 2-9, 59, o 11-19, o un suo frammento.

In un aspetto correlato, l'invenzione fornisce un polipeptide isolato codificato dalla molecola di acido nucleico dell'invenzione sopra descritta. In una forma di realizzazione della presente invenzione, il polipeptide isolato comprende la sequenza amminoacidica selezionata dal gruppo costituito da: a) una sequenza di amminoacidi di cui in SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9; 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19; e b) una sequenza amminoacidica che ha il 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% di omologia di sequenza amminoacidica secondo uno). In un altro, il polipeptide isolato comprende la sequenza aminoacidica avente almeno 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 210, 220, 230, 240 o 250 aminoacidi contigui della sequenza amminoacidica di SEQ ID NOs: 5 o 18 (VP24); 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 contigua residui di amminoacidi della sequenza amminoacidica di SEQ ID Nn 6 o 17 (VP30); 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 310, 320 o contigui residui di aminoacidi del amminoacido sequenza di SEQ ID Nn 8 o 13 (VP40); 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 310, 320, 330, o 340 residui di aminoacidi contigui della sequenza amminoacidica di SEQ ID NOs: 7 o 12 (VP35); 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, o contigui 370 residui di aminoacidi della sequenza aminoacidica di SEQ ID Nn 4 o 15 (PSC); 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, o contigui 370 residui di aminoacidi della sequenza aminoacidica di SEQ ID Nn 59 o 16 (SSGP); 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 450, 500, 550, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, o 670 aminoacidi contigui della sequenza amminoacidica di SEQ ID Nn 9 o 14 (GP); 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 710, 720, o 730 aminoacidi contigui della sequenza amminoacidica di SEQ ID Nn 3 o 11 (NP); o di 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 450, 500, 550 , 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800 , 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2160, 2170, 2180, 2190, o 2200 residui di aminoacidi contigui della sequenza aminoacidica di SEQ ID Nn 2 o 19 (L).

In altri aspetti, l'invenzione riguarda l'uso di un isolato del virus occidentale hEbola per metodi diagnostici e terapeutici. In una forma di realizzazione, l'invenzione fornisce un metodo per rilevare, in un campione biologico di un immunospecifica anticorpi per il virus hEbola usando l'isolato del virus hEbola inventivo qui descritta, o qualsiasi inventivi proteine o polipeptidi, come descritto nel presente documento. In un'altra forma di realizzazione specifica, l'invenzione fornisce un metodo di screening per un anticorpo che si lega e neutralizza immunospecifically hEbola EboBun o EboIC o una loro combinazione. Tale anticorpo è utile per una immunizzazione passiva o immunoterapia di un soggetto infettato con hEbola.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un anticorpo isolato o un frammento antigene vincolante degli stessi che si lega immunospecifically ad un genere hEbola virus dell'Africa occidentale del trovato sopra descritta, e indicativamente compresa EboBun o EboIC. In una forma di realizzazione della presente invenzione, l'anticorpo isolato o un frammento antigene vincolante neutralizza loro un genere africano virus hEbola Ovest. In un altro, l'anticorpo isolato o un frammento antigene vincolante lega stessa immunospecifically al polipeptide inventivo sopra descritto. L'invenzione prevede inoltre anticorpi che si legano specificamente un polipeptide dell'invenzione codificata dalla sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 (EboBun) o 10 (EboIC), un suo frammento, o codificato da un acido nucleico comprendente una sequenza nucleotidica che si ibrida sotto condizioni stringenti alla sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 (EboBun) o 10 (EboIC) e / o qualsiasi epitopo hEbola EboBun, avente una o più attività biologica di un polipeptide dell'invenzione. Questi polipeptidi sono quelli mostrati in SEQ ID Nn 2-9, 59, e 11-19.Tali anticorpi includono, ma non sono limitati a, policlonali, monoclonali, multi-specifici specifici bi-, umano, anticorpi umanizzati, chimerici, gli anticorpi a catena singola, frammenti Fab, F (ab ') 2frammenti, disolfuro-linked FVS, intrabodies e frammenti contenenti sia un dominio VH o VL o anche una regione determinante complementare (CDR) che si lega specificamente ad un polipeptide dell'invenzione.

In altri aspetti, l'invenzione fornisce metodi per rilevare la presenza, l'attività o espressione del virus hEbola dell'invenzione in un materiale biologico, come le cellule, sangue, saliva, urina, ecc.L'attività aumentata o diminuita o l'espressione del virus hEbola in un campione rispetto a un campione di controllo possono essere determinati contattando il materiale biologico con un agente in grado di rilevare direttamente o indirettamente la presenza, l'attività o l'espressione del virus hEbola. In una forma di realizzazione della presente invenzione, gli agenti di rilevamento sono gli anticorpi o molecole di acido nucleico della presente invenzione. Gli anticorpi dell'invenzione possono anche essere usati per trattare la febbre emorragica.

In un aspetto correlato, l'invenzione fornisce un metodo per rilevare la presenza del virus hEbola inventivo sopra descritto in un campione biologico, il metodo comprendendo: (a) contattare il campione con un agente che si lega selettivamente al virus hEbola; e (b) rilevare se il composto si lega al virus hEbola nel campione. In una forma di realizzazione della presente invenzione, il campione biologico è scelto nel gruppo costituito da cellule; sangue; siero; plasma; feci; tamponi rettali, vaginali e congiuntivali. In un altro, l'agente che si lega al virus è un anticorpo. In un altro, l'agente che si lega al virus è una molecola di acido nucleico comprendente la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO: 1 o un complemento della stessa. In un altro, l'agente che si lega al virus è una molecola di acido nucleico comprendente una sequenza nucleotidica avente almeno 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, o 6600 nucleotidi contigui della sequenza nucleotidica di SEQ ID Nn 1 o 10, o un complemento della stessa.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un metodo per rilevare la presenza del polipeptide inventivo sopra descritto, in un campione biologico, il metodo comprendendo: (a) mettere a contatto il campione biologico con un agente che si lega selettivamente al polipeptide; e (b) rilevare se l'agente si lega al polipeptide nel campione. In una forma di realizzazione della presente invenzione, il campione biologico è scelto nel gruppo costituito da cellule; sangue; siero;plasma; feci; tamponi rettali, vaginali e congiuntivali. In un altro, l'agente che si lega al polipeptide è un anticorpo o un frammento di antigene vincolante della stessa.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un metodo per rilevare la presenza di una prima molecola di acido nucleico derivante dal virus hEbola inventivo sopra descritto in un campione biologico, il metodo comprende (a) contattare il campione biologico con un agente che si lega selettivamente al acido nucleico; e (b) rilevare se l'agente si lega al nucleotide nel campione. In una forma di realizzazione della presente invenzione, l'agente che si lega alla prima molecola di acido nucleico è una seconda molecola di acido nucleico comprendente la sequenza nucleotidica di SEQ ID NO: 1 o un complemento della stessa. In un altro, la seconda molecola di acido nucleico comprende almeno 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300 , 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900 , 5000, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, o 6600 nucleotidi contigui della sequenza nucleotidica di SEQ ID Nn 1 o 10, o un complemento della stessa.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un metodo per la propagazione del virus hEbola in cellule ospiti comprendenti infettare le cellule ospiti con un isolato di virus occidentale hEbola inventivo sopra descritto, coltivando le cellule ospiti per consentire al virus di moltiplicarsi, e raccogliere i virioni risultanti. Anche fornito dalla presente invenzione sono cellule ospiti infettate con il virus hEbola inventivo descritto sopra. In una forma di realizzazione della presente invenzione, la cellula ospite è una cellula primate.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un metodo per rilevare, in un campione biologico la presenza di un anticorpo che si lega immunospecifically virus hEbola, il metodo comprende: (a) mettere a contatto il campione biologico con la cellula ospite inventivo sopra descritto; e (b) rilevare l'anticorpo legato alla cella.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce preparazioni di vaccino, compreso il virus hEbola inventivo, comprese le forme ricombinanti e chimeriche del virus, molecole di acido nucleico compresi dal virus o subunità proteiche del virus. In una forma di realizzazione, le preparazioni di vaccino della presente invenzione comprende vivo ma attenuato del virus hEbola con o senza vettori farmaceuticamente accettabili, compresi coadiuvanti. In un altro, le preparazioni vaccinali dell'invenzione comprendono un virus inattivato o ucciso hEbola EboBun, virus EboIC, o una loro combinazione, con o senza vettori farmaceuticamente accettabili, compresi i coadiuvanti. Tali virus attenuati o inattivati possono essere preparate da una serie di passaggi del virus attraverso le cellule ospiti o per la preparazione di forme ricombinanti o chimeriche di virus. Di conseguenza, la presente invenzione fornisce inoltre metodi per preparare forme ricombinanti o chimeriche dei virus hEbola inventivi qui descritti.

In un'altra forma di realizzazione specifica, l'invenzione fornisce una formulazione di vaccino comprendente una quantità terapeuticamente efficace o profilassi del virus hEbola inventivo sopra descritto, e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In un altro, l'invenzione fornisce una formulazione di vaccino comprendente una quantità terapeuticamente o profilatticamente efficace di un estratto proteico del virus inventivo hEbola descritto sopra, o una subunità della stessa; e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In un altro aspetto, l'invenzione fornisce una formulazione di vaccino comprendente una quantità terapeuticamente efficace o profilassi di una molecola di acido nucleico comprendente la sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10, o un complemento della stessa, e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In un altro, l'invenzione fornisce una formulazione di vaccino comprendente una quantità terapeuticamente efficace o profilassi di una molecola di acido nucleico comprendente una delle sequenze nucleotidiche inventivi come descritto sopra, o un complemento della stessa, e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In un altro aspetto, l'invenzione fornisce una formulazione di vaccino comprendente una quantità terapeuticamente o profilatticamente efficace di un estratto proteico del virus inventivo hEbola descritto sopra, o una subunità della stessa; e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In un altro aspetto, l'invenzione fornisce una formulazione di vaccino comprendente una quantità terapeuticamente efficace o profilassi di una molecola di acido nucleico comprendente la sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10, o un complemento della stessa, e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In un altro, l'invenzione fornisce una formulazione di vaccino comprendente una quantità terapeuticamente efficace o profilassi di una molecola di acido nucleico comprendente una delle sequenze nucleotidiche inventivi come descritto sopra, o un complemento della stessa, e un veicolo farmaceuticamente accettabile.

In un'altra forma di realizzazione specifica, le preparazioni di vaccino della presente invenzione comprendono un acido nucleico o frammento del virus hEbola, ad esempio, il virus avente adesione No. 200706291, o molecole di acido nucleico avente la sequenza di SEQ ID NOs: 1 o 10, o un suo frammento. In un'altra, le preparazioni di vaccino comprendono un polipeptide dell'invenzione codificata dalla sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10 o un suo frammento. In una forma di realizzazione specifica, le preparazioni di vaccini comprendono polipeptidi dell'invenzione come mostrato in SEQ ID NOs: 2-9, 59, o 11-19, o codificata dalla sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10, o un suo frammento .

Inoltre, la presente invenzione fornisce metodi per il trattamento, ameliorating, gestire o prevenire febbre emorragica somministrando le preparazioni vaccinali o anticorpi della presente invenzione solo o in combinazione con adiuvanti, o altri eccipienti farmaceuticamente accettabili. Inoltre, la presente invenzione fornisce metodi per il trattamento, ameliorating, la gestione, o prevenire febbre emorragica somministrando composizioni inventive e le formulazioni comprese le preparazioni vaccinali o anticorpi della presente invenzione da solo o in combinazione con farmaci antivirali [ad esempio, amantadina, rimantadina, gancyclovir, aciclovir, ribavirina, penciclovir, oseltamivir, zidovudina foscamet (AZT), didanosina (ddl), lamivudina (3TC), zalcitabina (DDC), stavudina (d4T), nevirapina, delavirdina, indinavir, ritonavir, vidarabine, nelfinavir, saquinavir, Relenza, tamiflu, pleconaril, interferoni, ecc], steroidi e corticosteroidi come il prednisone, cortisone, fluticasone e glucocorticoidi, antibiotici, analgesici, broncodilatatori, o altri trattamenti per le vie respiratorie e / o infezioni virali.

In un altro aspetto correlato, l'invenzione fornisce una formulazione immunogenica comprendente una quantità efficace di un immunogenically estratto proteico del virus hEbola inventivo descritto sopra o una subunità della stessa, e un veicolo farmaceuticamente accettabile.

In un altro aspetto correlato, l'invenzione fornisce una formulazione immunogenica comprendente una quantità immunogenically efficace di una molecola di acido nucleico comprendente la sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1, 10, una combinazione di questi, o un complemento della stessa, ed un vettore farmaceuticamente accettabile.

In un altro aspetto correlato, l'invenzione fornisce una formulazione immunogenica comprendente una quantità immunogenically efficace di una molecola di acido nucleico comprendente la sequenza nucleotidica inventiva come descritto sopra o un complemento della stessa, e un veicolo farmaceuticamente accettabile.

In un altro aspetto correlato, l'invenzione fornisce una formulazione immunogenica comprendente una quantità immunogenically efficace di qualsiasi dei polipeptidi inventivi sopra descritti.

In un aspetto correlato, l'invenzione fornisce una composizione farmaceutica comprendente una quantità profilattica o terapeuticamente efficace di un agente anti-hEbola EboBun e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In una forma di realizzazione della presente invenzione, l'agente anti-EboBun hEbola è un anticorpo o un frammento di antigene vincolante degli stessi che si lega immunospecifically al virus hEbola di deposito adesione No. 200706291, o polipeptidi o proteine derivati. In un altro, l'anti-hEbola agente è una molecola di acido nucleico comprendente la sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1, 10, una combinazione di questi, o un suo frammento. In un altro, l'agente anti-hEbola è un polipeptide codificato da una molecola di acido nucleico comprendente la sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1, 10, una combinazione di questi, o un suo frammento avente un'attività biologica del polipeptide.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un kit comprende un contenitore contenente la formulazione del vaccino inventivo sopra descritto.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un kit comprendente un contenitore contenente la composizione farmaceutica inventivo sopra descritto.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un kit comprendente un recipiente contenente la formulazione del vaccino inventivo sopra descritto.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce un metodo per identificare un soggetto infettato con il virus hEbola inventivo sopra e descritto: (a) ottenere RNA totale da un campione biologico ottenuto dal soggetto; (B) operazioni di trascrivere l'RNA totale per ottenere cDNA; e (c) amplificare il cDNA utilizzando un set di primer derivati da una sequenza nucleotidica del virus hEbola inventivo sopra descritto.

In una forma di realizzazione della presente invenzione, la serie di primer sono derivati dalla sequenza nucleotidica del genoma del virus hEbola di deposito adesione No. 200706291. In un altro, la serie di primer sono derivati dalla sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10 o una qualsiasi delle sequenze nucleotidiche inventivi come sopra descritto, o un complemento del loro.

L'invenzione riguarda inoltre l'uso delle informazioni di sequenza del virus isolato per metodi diagnostici e terapeutici. In una forma di realizzazione specifica, l'invenzione fornisce molecole di acido nucleico che sono adatti per l'uso come primer consistente in o comprendente la sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10, o un complemento della stessa, o almeno una parte della sequenza nucleotidica della stessa. In un'altra forma di realizzazione specifica, l'invenzione fornisce molecole di acido nucleico che sono adatti per l'ibridazione dell'acido nucleico hEbola inventivo; tra cui, ma non limitato a primer PCR, Reverse primer trascrittasi sonde per l'analisi Southern o altra analisi di ibridazione degli acidi nucleici per il rilevamento di acidi nucleici hEbola, ad esempio, consistente in o comprendente la sequenza nucleotidica di SEQ ID Nn 1, 10 una combinazione thereof, un complemento della stessa, o una sua porzione. L'invenzione comprende inoltre i virus chimerici o ricombinanti codificati in tutto o in parte dalle sequenze nucleotidiche.

In un altro aspetto, la presente invenzione fornisce metodi di screening per agenti antivirali che inibiscono l'infettività e la replicazione del virus hEbola o varianti della stessa.

L'invenzione fornisce inoltre metodi di preparazione di forme ricombinanti o chimeriche di hEbola.

In un altro aspetto, l'invenzione fornisce preparazioni di vaccino compreso il virus hEbola, comprese le forme ricombinanti e chimeriche del virus, o subunità del virus. La presente invenzione comprende virus ricombinanti o chimerici codificate dai vettori virali derivati dal genoma del virus hEbola inventiva qui descritte o naturali varianti della stessa. In una forma specifica, un virus ricombinante è un derivato dal virus hEbola di deposito adesione No. 200706291. Si riconosce che le varianti naturali dei virus hEbola inventivi qui descritti comprendono una o più mutazioni, tra cui, ma non limitato a, mutazioni puntiformi , riarrangiamenti, inserimenti, cancellazioni, ecc, alla sequenza genomica. Si riconosce che le mutazioni possono o non possono comportare un cambiamento fenotipico.

In un'altra forma di realizzazione specifica, un virus chimerico dell'invenzione è un virus ricombinante hEbola EboBun o EboIC che comprende inoltre una sequenza nucleotidica eterologa. In accordo con l'invenzione, un virus chimerico può essere codificato da una sequenza nucleotidica in cui sono state aggiunte sequenze nucleotidiche eterologhe al genoma o in cui sequenze nucleotidiche endogene o nativi sono stati sostituiti con sequenze nucleotidiche eterologhe.

Secondo la presente invenzione, i virus chimerici sono codificati dai vettori virali dell'invenzione che comprendono ulteriormente una sequenza nucleotidica eterologa. In accordo con la presente invenzione è un virus chimerico è codificato da un vettore virale che possono o non possono includere acidi nucleici che sono non-nativi del genoma virale. In accordo con l'invenzione un virus chimerico è codificato da un vettore virale a cui sono state aggiunte sequenze nucleotidiche eterologhe, inserito o sostituito sequenze nativi o non nativi. Secondo la presente invenzione, il virus chimerico può essere codificata da sequenze nucleotidiche derivate da specie o varianti di virus hEbola differenti. In particolare, il virus chimerico è codificata da sequenze nucleotidiche che codificano polipeptidi antigenici derivati da specie o varianti di virus hEbola differenti.

Un virus chimerico può essere di particolare utilità per la generazione di vaccini ricombinanti protezione contro due o più virus (Tao et al, J. Virol 72, 2955-2961,.... Durbin et al, 2000, J. Virol 74, 6821 -6831;. Skiadopoulos et al, 1998, J. Virol 72, 1762-1768 (1998);.. Teng et al, 2000, J. Virol 74, 9317-9321).. Ad esempio, può essere previsto che un vettore del virus derivato dal virus hEbola esprimere una o più proteine di varianti del virus hEbola compreso hEbola EboBun, o viceversa, protegge un soggetto vaccinato con tale vettore contro le infezioni sia dalla nativa hEbola e la variante. Virus attenuati e replica-difettosi possono essere di uso per scopi di vaccinazione con vaccini vivi come è stato suggerito per altri virus. (Vedi, per esempio, PCT WO 02/057302, pagg 6 e 23;. Ed United States Patent Application pubblicazione 2008/0069838 incorporato per riferimento nel presente documento).

Secondo la presente invenzione la sequenza eterologa da incorporare nei vettori virali codificanti i virus ricombinanti o chimerici dell'invenzione includono sequenze ottenute o derivate da specie o varianti di hEbola differenti.

In alcune forme di realizzazione, i virus chimerici o ricombinanti dell'invenzione sono codificati da vettori virali derivati da genomi virali in cui una o più sequenze, regioni intergeniche, sequenze Termini, o parti o l'intero ORF sono stati sostituiti con una sequenza eterologa o non nativa. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, i virus chimerici dell'invenzione sono codificati da vettori virali derivati da genomi virali in cui una o più sequenze eterologhe sono state inserite o aggiunti al vettore.

La selezione del vettore virale può dipendere dalle specie del soggetto che deve essere trattata o protetto da una infezione virale. Se il soggetto è umano, quindi un virus attenuato hEbola può essere utilizzato per fornire le sequenze antigeniche.

In accordo con la presente invenzione, i vettori virali possono essere progettati per fornire sequenze antigeniche che conferiscono protezione contro l'infezione da parte inventiva hEbola e varianti naturali della stessa. I vettori virali possono essere progettati per fornire uno, due, tre o più sequenze antigeniche. Secondo la presente invenzione le sequenze antigeniche possono essere derivate dallo stesso virus, da specie o varianti dello stesso tipo di virus, o da diversi virus differenti.

I prodotti di espressione e / o ricombinante o chimerici virioni ottenuti secondo l'invenzione possono vantaggiosamente essere utilizzati in formulazioni di vaccino. I prodotti di espressione e virioni chimeriche della presente invenzione possono essere progettati per creare vaccini contro una vasta gamma di agenti patogeni, inclusi gli antigeni virali e batterici, antigeni tumorali, antigeni, allergeni e antigeni auto coinvolte nei disordini autoimmuni. Un modo per raggiungere questo obiettivo tratta di modificare i geni hEbola esistenti per contenere sequenze stranieri nei loro rispettivi domini esterni. Quando le sequenze eterologhe sono epitopi o antigeni di patogeni, questi virus chimerici possono essere usati per indurre una risposta immunitaria protettiva contro l'agente patogeno da cui questi determinanti sono derivati. In particolare, i virioni chimeriche della presente invenzione possono essere progettati per generare vaccini per la protezione di un soggetto da infezioni da virus hEbola e varianti della stessa.

Pertanto, la presente invenzione riguarda inoltre l'uso di vettori virali e virus chimerici ricombinanti o per formulare vaccini contro una vasta gamma di virus e / o antigeni. La presente invenzione comprende anche i virus ricombinanti, compreso un vettore virale derivato dal hEbola o varianti di ciò che contiene sequenze che comportano un virus avente un fenotipo più adatto per l'uso in formulazioni di vaccino, per esempio, fenotipo attenuato o maggiore antigenicità. Le mutazioni e le modifiche possono essere in regioni codificanti, nelle regioni intergeniche e nel leader e rimorchio sequenze del virus.

L'invenzione fornisce una cellula ospite compreso un acido nucleico o un vettore secondo l'invenzione. Plasmidi o vettori virali contenenti i componenti polimerasi del virus hEbola sono generati in cellule procariote per l'espressione dei componenti rilevanti tipi di cellule (batteri, cellule di insetto, cellule eucariotiche). Plasmidi o vettori virali contenenti full-length o copie parziali del genoma hEbola saranno generati nelle cellule procariote per l'espressione di acidi nucleici virali in vitro o in vivo. Quest'ultimo vettori contengono facoltativamente altre sequenze virali per la generazione di virus chimerici o proteine virali chimeriche, parti mancanza facoltativamente del genoma virale per la generazione di replicazione del virus difettoso, e opzionalmente contengono mutazioni, delezioni o inserzioni per la generazione di virus attenuati.Inoltre, la presente invenzione fornisce una cellula ospite infettata con il virus hEbola di deposito adesione n ° 200706291,

Copie infettive dell'Africa occidentale hEbola (essendo wild type, attenuato, replica-difettoso o chimerica) sono opzionalmente realizzano su co-espressione dei componenti polimerasi secondo le tecnologie state-of-the-art di cui sopra.

Inoltre, le cellule eucariotiche, transitoriamente o stabilmente esprimere uno o più full-length o proteine hEbola parziali sono opzionalmente utilizzato. Tali cellule sono preferibilmente realizzati da trasfezione (proteine o vettori di acidi nucleici), infezione (vettori virali) o trasduzione (vettori virali) e sono utili per complementazione di tipo menzionato selvaggia, attenuato, replica-difettoso o virus chimerici.

I vettori virali e virus chimerici della presente invenzione opzionalmente modulano il sistema immunitario di un soggetto stimolando una risposta immunitaria umorale, una risposta immunitaria cellulare o stimolando la tolleranza ad un antigene. Nel presente, un soggetto significa: gli esseri umani, primati, cavalli, mucche, pecore, maiali, capre, cani, gatti, roditori e specie aviarie.

Formulazione di vaccini e farmaci antivirali

In una forma di realizzazione preferita, l'invenzione fornisce una molecola proteica o virus hEbola proteine virali specifici o frammento funzionale di esso codificata da un acido nucleico secondo l'invenzione. Molecole proteiche utili sono ad esempio derivati da uno dei geni o frammenti genomici derivabili dal virus secondo l'invenzione, preferibilmente i GP, L, NP, SGP, VP24, VP30, VP35, e VP 40 proteine qui descritti. Tali molecole, o frammenti antigenici della stessa, come previsto nel presente documento, sono ad esempio utili in metodi diagnostici o kit e in composizioni farmaceutiche come i vaccini subunità. Particolarmente utili sono i polipeptidi codificati dalla sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10; o frammenti antigenici loro per l'inclusione come antigene o subunità immunogeno, ma virus intero inattivato possono anche essere utilizzati. Particolarmente utili sono anche le sostanze proteiche che sono codificati da frammenti di acidi nucleici ricombinanti del genoma hEbola, naturalmente preferito sono quelli che sono entro i limiti privilegiate e metes di ORF, in particolare, per suscitare hEbola anticorpo specifico o risposte delle cellule T, se in vivo (ad esempio per scopi protettivi o terapeutici o per fornire anticorpi diagnostici) o in vitro (ad esempio con tecnologia phage display o un'altra tecnica utile per generare anticorpi sintetici).

Si riconosce che numerose varianti, analoghi o omologhi di polipeptidi EboBun rientrano nell'ambito di applicazione della presente invenzione compresi sostituzioni di aminoacidi, alterazioni, modifiche o altre modifiche di aminoacidi che aumentano, diminuire, o non alterano la funzione o propensione immunogenico del immunogeno inventiva o vaccino. Diverse modificazioni post-traduzionali sono ugualmente immaginato come nell'ambito della presente invenzione indicativamente compresa l'incorporazione di un amminoacido non naturale (s), fosforilazione, glicosilazione, solfatazione, e l'aggiunta di gruppi pendenti, come biotynlation, fluorofori, lumiphores, gruppi radioattivi, antigeni, o altre molecole.

Metodi di esprimere e purificare peptidi naturali o ricombinanti e proteine sono ben noti nell'arte.Indicativamente, peptidi e proteine ricombinanti espresse in cellule eucariotiche. Cellule eucariotiche esemplari includono lievito, cellule HeLa, cellule 293, COS cellule, cellule ovariche di criceto cinese (CHO), e molti altri tipi di cellule noti nell'arte. Entrambi i sistemi di espressione eucariotici e procariotici e le cellule sono disponibili indicativamente da Invitrogen Corp., Carlsbad, in California. È noto che i sistemi di espressione cell-free sono ugualmente operabile.

In una forma di realizzazione preferita di un polipeptide immunogenico è una proteina di lunghezza completa EboBun. Preferibilmente, un immunogeno è una proteina completa lunghezza EboBun di SEQ ID Nn 2-9 o 59, o EboIC SEQ ID Nn 11-19, o un frammento di esso, come descritto nel presente documento. Preferibilmente, un immunogeno è ha un minimo di 5 aminoacidi. Come usato qui un immunogeno è preferibilmente un polipeptide. Nel contesto di un polipeptide immunogenico i termini immunogeno, polipeptide, e antigene vengono usati in modo intercambiabile.

Le modifiche e le modifiche possono essere apportate nella struttura dei immunogeni inventivi che sono l'oggetto della domanda ed ancora ottengono una molecola avente caratteristiche simili o migliorate, come la sequenza wild-type (ad esempio, un conservatore aminoacidi sostituzione).Ad esempio, alcuni aminoacidi sono eventualmente sostituiti per altri aminoacidi in una sequenza senza perdita apprezzabile di attività immunogenica. Poiché è la capacità interattiva e la natura di un polipeptide che definisce quella biologica attività funzionale del polipeptide, alcune sostituzioni sequenza amminoacidica può essere effettuato in una sequenza polipeptidica e comunque ottenere un polipeptide con proprietà simili o migliorate. Facoltativamente, un polipeptide viene utilizzato con azione più o meno immunogenico rispetto alla sequenza wild-type.

Nel fare tali modifiche, l'indice termale di amminoacidi è preferibilmente considerato. L'importanza dell'indice aminoacido termica solo nel conferire funzione biologica interattivo su un polipeptide è generalmente inteso nell'arte. È noto che alcuni aminoacidi possono essere sostituiti per altri amminoacidi avente indice idropatica simile o segnare e ancora comportare un polipeptide con attività biologica simile. Ogni amminoacido è stato assegnato un indice termica solo sulla base delle sue caratteristiche di idrofobicità e carica. Tali indici sono: isoleucina (+4,5); valina (+4,2);leucina (+3,8); fenilalanina (+2.8); cisteina / cisteina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8);glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); istidina (-3,2); glutammato (-3,5); glutammina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5).

Si ritiene che il carattere idropatico relativo della amminoacido determina la struttura secondaria del polipeptide risultante, che a sua volta definisce l'interazione del polipeptide con altre molecole, come gli enzimi, substrati, recettori, anticorpi, antigeni, e simili. È noto nella tecnica che un amminoacido può essere sostituito da un altro amminoacido avente indice idropatica simile e ancora ottenere un immunogeno funzionalmente equivalente. In tali cambiamenti, la sostituzione di aminoacidi i cui indici sono idropatico entro ± 2 è preferito, quelli entro ± 1 sono particolarmente preferito, e quelli entro ± 0.5 sono ancora più particolarmente preferito.

Come indicato sopra, sostituzioni di aminoacidi sono generalmente basati sulla relativa somiglianza dei aminoacidi sostituenti della catena laterale, per esempio, la loro idrofobicità, idrofilia, carica, le dimensioni, e simili. Sostituzioni esemplari che prendono varie delle caratteristiche precedenti in considerazione sono ben noti a quelli di abilità nell'arte e comprendono (residuo originale: sostituzione esemplare): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, La sua), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (il suo: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Suggerimento: Tyr), (Tyr: Trp, Phe), e (Val: Ile , Leu). Incarnazioni della presente informativa contemplano quindi equivalenti funzionali o biologiche di un polipeptide e immunogeno come indicato sopra. In particolare, le forme di attuazione polipeptidi e immunogeni opzionalmente includono varianti con circa il 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 95% di identità di sequenza per il polipeptide di interesse.

L'invenzione fornisce formulazioni di vaccino per la prevenzione e il trattamento delle infezioni da virus hEbola. In alcune forme di realizzazione, il vaccino della invenzione comprende virus ricombinanti chimerici e del virus hEbola. In alcune forme di realizzazione, il virus è attenuato.

In un'altra forma di realizzazione di questo aspetto dell'invenzione, le formulazioni di vaccini inattivati sono preparate usando tecniche convenzionali di "uccidere" i virus chimerici. Vaccini inattivati sono "morti", nel senso che la loro infettività è stata distrutta. Idealmente, l'infettività del virus viene distrutto senza compromettere la sua immunogenicità. Al fine di preparare i vaccini inattivati, il virus chimerico può essere coltivata in coltura cellulare o in allantoide dell'embrione pulcino, purificato da ultracentrifugazione zonale, inattivato da formaldeide o β-propiolattone, e messo in comune. Il vaccino risultante è solitamente inoculato per via intramuscolare o per via intranasale.

Virus inattivati sono eventualmente formulati con un adiuvante idonea al fine di migliorare la risposta immunologica. Tali coadiuvanti illustratively includono ma non sono limitati a gel minerali, per esempio, idrossido di alluminio; superficie sostanze attive, come lisolecitina, polioli Pluronic, polianioni; peptidi; emulsioni di olio; e coadiuvanti umane potenzialmente utili come BCG eCorynebacterium parvum.

In un altro aspetto, la presente invenzione fornisce anche formulazioni di vaccino di DNA compreso un acido nucleico o frammento del virus hEbola inventivo, ad esempio, il virus avente adesione No. 200706291, o molecole di acido nucleico avente la sequenza di SEQ ID NOs: 1 o 10, o un suo frammento. In un'altra forma di realizzazione specifica, le formulazioni di vaccino di DNA della presente invenzione comprendono un acido nucleico o suo frammento codificante gli anticorpi che legano immunospecifically virus hEbola. Nel DNA formulazioni di vaccino, un DNA vaccino comprende un vettore virale, quale quella derivante dal virus hEbola, plasmide batterico o altro vettore di espressione, recanti un inserto compreso una molecola di acido nucleico della presente invenzione è operativamente legato a uno o più elementi di controllo , consentendo in tal modo l'espressione delle proteine codificate da vaccinare la molecola di acido nucleico in un soggetto vaccinato. Tali vettori possono essere preparati mediante la tecnologia del DNA ricombinante come vettori virali ricombinanti o chimerici che trasportano una molecola di acido nucleico della presente invenzione.

Un acido nucleico qui utilizzato si riferisce alla singola o molecole a doppia elica del DNA, che sono opzionalmente, comprese le basi nucleotidiche A, T, C e G, o RNA, comprese le basi A, U (sostituti per T), C, e G. L'acido nucleico può rappresentare un filamento codificante o suo complemento. Gli acidi nucleici sono opzionalmente identico in sequenza alla sequenza che è presente in natura o comprende codoni alternativi che codificano lo stesso amminoacido come quella che si trova nella sequenza naturale. Inoltre, gli acidi nucleici comprendono opzionalmente codoni che rappresentano sostituzioni conservative di amminoacidi come sono ben noti nella tecnica.

Come usato qui, il termine "acido nucleico isolato" si intende un acido nucleico separato o sostanzialmente privo di almeno alcuni degli altri componenti dell'organismo naturale, per esempio, i componenti strutturali di cellule che si trovano comunemente associati con acidi nucleici in un ambiente cellulare e / o altri acidi nucleici. L'isolamento di acidi nucleici è indicativamente realizzato con tecniche quali la lisi cellulare seguita da estrazione con fenolo cloroformio più, seguito da precipitazione in etanolo degli acidi nucleici. Gli acidi nucleici della presente invenzione sono indicativamente isolati da cellule secondo metodi ben noti nell'arte per isolare acidi nucleici. In alternativa, gli acidi nucleici della presente invenzione sono facoltativamente sintetizzati secondo protocolli standard ben descritti in letteratura per la sintesi di acidi nucleici. Le modifiche agli acidi nucleici dell'invenzione sono anche contemplate, a condizione che la struttura essenziale e la funzione del peptide o polipeptide codificato dall'acido nucleico vengono mantenute.

L'acido nucleico codificante il peptide o polipeptide della presente invenzione è facoltativamente parte di un costrutto di acido nucleico ricombinante comprendente una combinazione di siti di restrizione e / o elementi funzionali, come ben noto nell'arte che facilitano la clonazione molecolare e altre manipolazioni del DNA ricombinante. Pertanto, la presente invenzione fornisce inoltre un costrutto di acido nucleico ricombinante compreso un acido nucleico che codifica un polipeptide della presente invenzione.

Generalmente, può essere più conveniente impiegare il polinucleotide ricombinante una versione cDNA del polinucleotide. Si ritiene che l'uso di una versione cDNA fornirà vantaggi dal fatto che la dimensione del gene sarà generalmente molto più piccoli e più facilmente impiegato per trasfettare le cellule bersaglio che voglia un gene genomico, che saranno generalmente essere fino a un ordine di grandezza maggiore del gene cDNA. Tuttavia, l'inventore non esclude la possibilità di impiegare una versione genomico di un particolare gene ove desiderato.

Come qui usati i termini "progettati" e le cellule "ricombinanti" sono sinonimo di cellule "ospitanti" e sono destinati a fare riferimento a una cella in cui è stato introdotto un segmento di DNA esogeno o gene, come ad esempio un cDNA o gene. Pertanto, le cellule ingegnerizzate sono distinguibili dalle naturalmente le cellule che non contengono un segmento di DNA esogeno introdotto ricombinante o gene che si verificano. Una cellula ospite è opzionalmente una cellula naturale che si trasforma con un segmento di DNA esogeno o gene o una cella che non viene modificato. Una cellula ospite preferibilmente non possiede un gene che codifica per la proteina presente in natura RSV G. Cellule ingegnerizzate sono, quindi, le cellule che hanno uno o più geni introdotti attraverso la mano dell'uomo. Cellule ricombinanti illustratively sono quelli che hanno una cDNA introdotte o DNA genomico, e comprendono anche i geni posizionati adiacente ad un promotore naturale non associato al particolare gene introdotto.

Per esprimere un polipeptide codificato ricombinante secondo la presente invenzione si prepara opzionalmente un vettore di espressione comprendente un polinucleotide sotto il controllo di uno o più promotori. Per portare una sequenza codificante "sotto il controllo di" un promotore, un posiziona 'estremità del sito di inizio della traduzione della cornice di lettura generalmente tra circa 1 e 50 nucleotidi "a valle" della (cioè, 3' il 5) il promotore prescelto . Il promotore "a monte" stimola la trascrizione del DNA inserito e promuove l'espressione della proteina ricombinante codificata. Questo è il significato di "espressione ricombinante" nel contesto qui utilizzato.

Molte tecniche standard sono disponibili per costruire vettori di espressione contenenti gli opportuni acidi nucleici e trascrizionali / sequenze di controllo traslazionali per conseguire proteina o peptide espressione in una varietà di sistemi ospite-espressione. Tipi di cellule disponibili per l'espressione comprendono, ma non sono limitati a, i batteri, come E. coli e B.subtilis trasformate con DNA fago ricombinante, DNA plasmidico o vettori di espressione del DNA cosmidi.

Alcuni esempi di ospiti procariote illustratively includono E. coli ceppo RR1, E. coli LE392, E. coliB, E. coli 1776 (ATCC No. 31537), così come E. coli W3110 (F, lambdacia-, prototrofici, ATCC No. 273.325); bacilli come il Bacillus subtilis ; e altri enterobatteri quali Salmonella typhimurium, Serratia marcescens , e varie Pseudomonas specie.

In generale, vettori plasmidici contenenti replicone e controllo sequenze che sono derivati da specie compatibili con la cellula ospite sono utilizzati in relazione a questi host. Il vettore trasporta ordinariamente un sito di replica, così come sequenze di marcatura che sono in grado di fornire la selezione fenotipica in cellule trasformate. Ad esempio, E. coli è spesso trasformata mediante pBR322, un plasmide derivato da E. coli specie. Plasmide pBR322 contiene geni per ampicillina e resistenza alla tetraciclina e quindi offre un modo facile per identificare cellule trasformate. Il plasmide pBR322, o altro plasmide o fago microbica possono anche contenere, o essere modificato per contenere, i promotori che possono essere utilizzati dall'organismo microbica per l'espressione delle proprie proteine.

Inoltre, i vettori fagi contenenti replicone e controllo sequenze che sono compatibili con il microrganismo ospitante che vengono eventualmente utilizzati come vettori di trasformazione in relazione a questi host. Ad esempio, il fago lambda è opzionalmente utilizzato nel fare un vettore fago ricombinante che può essere utilizzato per trasformare cellule ospiti, come E. coli LE392.

Vettori di alcune utili includono vettori PIN e vettori pGEX, per l'impiego nella generazione di glutatione S-transferasi (GST), proteine di fusione solubile per la purificazione dopo e separazione o scissione. Altre proteine di fusione adatti sono quelli con β-galattosidasi, ubiquitina, o simili.

I promotori che sono più comunemente utilizzati nella costruzione del DNA ricombinante sono il β-lattamasi (penicillinasi) triptofano (trp) sistemi promotore, lattosio e. Mentre questi sono i più comunemente utilizzati, altri promotori microbici sono stati scoperti e utilizzati, e dettagli sulle loro sequenze nucleotidiche sono state pubblicate, consentendo quelli di abilità nell'arte di legare loro funzionalmente con vettori plasmidici.

Per l'espressione in Saccharomyces , il plasmide YRp7, per esempio, è comunemente usato.Questo plasmide contiene il gene TRP1, che fornisce un marker di selezione per un ceppo mutante di lievito priva della capacità di crescere in triptofano, per esempio ATCC No. 44076 o PEP4-1. La presenza della lesione TRP1 come caratteristica del genoma della cellula ospite di lievito fornisce quindi un ambiente efficace per la rilevazione trasformazione dalla crescita in assenza di triptofano.

Idonei a promuovere le sequenze di vettori di lievito sono indicativamente i promotori di chinasi 3-fosfoglicerato o di altri enzimi glicolitici, come enolasi, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, esochinasi, piruvato decarbossilasi, fosfofruttochinasi, glucosio-6-fosfato isomerasi, 3-fosfoglicerato mutasi, piruvato chinasi, isomerasi triosephosphate, fosfoglucosio isomerasi e glucochinasi. Nel costruire opportuni plasmidi di espressione, le sequenze di terminazione associati a questi geni sono anche preferibilmente ligati nel vettore di espressione 3 'della sequenza desiderata da esprimere a fornire poliadenilazione dell'mRNA e la terminazione.

Altri promotori adatti, che presentano il vantaggio supplementare di trascrizione controllata dalle condizioni di crescita, indicativamente includono la regione del promotore per alcol deidrogenasi 2, isocytochrome C, fosfatasi acida, enzimi degradativi associati con il metabolismo dell'azoto e la deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato suddetto, e enzimi responsabili di maltosio e galattosio utilizzo.

Oltre a microrganismi, colture di cellule derivate da organismi pluricellulari sono operabili come padroni di casa. In linea di principio, tale coltura cellulare è utilizzabile, sia da vertebrati o invertebrati cultura. Oltre alle cellule di mammifero, questi includono sistemi cellulari di insetto infettate con vettori di espressione del virus ricombinante (ad esempio, baculovirus); e sistemi di cellule vegetali infettate con vettori di espressione virus ricombinanti (ad esempio, virus del mosaico del cavolfiore, CaMV; virus del mosaico del tabacco, TMV) o trasformato con vettori di espressione plasmidici ricombinante (ad esempio, Ti plasmide) che contiene uno o più sequenze codificanti.

In un sistema di insetto utile, Autographica californica virus della poliedrosi nucleare (AcNPV) è utilizzato come vettore per esprimere geni estranei. Il virus cresce in frugiperda Spodopteracellule. L'acido nucleico isolato codificante sequenze vengono clonati in regioni non essenziali (per esempio il gene poliedro) del virus e posta sotto il controllo di un promotore AcNPV (per esempio, il promotore poliedro). Inserimento di successo delle sequenze codificanti risultati nella inattivazione del gene poliedro e la produzione di virus ricombinante non occluso (cioè, virus manca il cappotto proteica codificata dal gene poliedro). Questi virus ricombinanti vengono poi utilizzati per infettare frugiperda Spodoptera cellule in cui il gene inserito è espresso (ad esempio, US Pat. No. 4.215.051).

Esempi di linee cellulari di mammifero ospite utili includono VERO e HeLa, cellule ovariche di criceto (CHO) linee cellulari cinesi, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN e linee cellulari MDCK. Inoltre, una cellula ospite è preferibilmente scelto che modula l'espressione delle sequenze inserite oppure modifica e trasforma il prodotto genico in modo specifico desiderato.Tali modifiche (ad esempio, glicosilazione) ed elaborazione (ad esempio, clivaggio) di prodotti proteici può essere importante per la funzione della proteina codificata.

Diverse cellule ospiti hanno meccanismi caratteristici e specifici per il trattamento post-traduzionale e la modifica delle proteine. Linee cellulari adeguate o sistemi host sono preferibilmente scelti per assicurare la modifica e l'elaborazione corretta della proteina estranea espressa. Vettori di espressione per l'uso in cellule di mammifero di solito includono una origine di replicazione (se necessario), un promotore situato di fronte al gene da esprimere, insieme a qualsiasi siti, siti di splicing dell'RNA, sito di poliadenilazione, e sequenze di terminazione di trascrizione vincolante ribosoma necessario. L'origine di replicazione è preferibilmente fornito mediante la costruzione del vettore per includere una origine esogena, come ad esempio può essere derivato da SV40 o altri virale (per esempio, Polioma, adeno, VSV, BPV) fonte, o può essere fornito dalla cellula ospite meccanismo di replica cromosomica. Se il vettore è integrato nel cromosoma della cellula ospite, quest'ultimo è spesso sufficiente.

I promotori sono eventualmente derivate dal genoma di cellule di mammifero (ad esempio, promotore metallotioneina) o da virus dei mammiferi (ad esempio, alla fine degli anni promotore adenovirus, virus vaccinico promotore 7.5K). Inoltre, è anche possibile, e può essere desiderabile, per utilizzare promotore o sequenze di controllo normalmente associati con la sequenza del gene desiderato, purché tali sequenze di controllo sono compatibili con i sistemi della cellula ospite.

Un certo numero di sistemi di espressione basati virali sono operabili qui, per esempio, promotori comunemente usati sono derivati da polioma, adenovirus 2, Adenovirus 5, citomegalovirus e Simian Virus 40 (SV40). I promotori precoci e tardivi del virus SV40 sono utili perché entrambi si ottengono facilmente dal virus come un frammento che contiene anche l'origine virale SV40 di replica. SV40 frammenti più piccoli o più grandi sono azionabili, in particolare quando è compreso sequenza bp circa 250 estendentesi dal sito HindIII verso il sito BglI situato nella origine di replicazione virale.

Nei casi in cui un adenovirus è utilizzato come un vettore di espressione, le sequenze codificanti sono preferibilmente ligati ad un complesso di adenovirus di trascrizione / traduzione di controllo, ad esempio, alla fine degli anni promotore e sequenza leader tripartita. Questo gene chimerico viene quindi opzionalmente inserito nel genoma di adenovirus in vitro o in vivo ricombinazione.Inserimento in una regione non essenziale del genoma virale (ad esempio, regione E1 o E3) si tradurrà in un virus ricombinante che è vitale e capace di esprimere proteine in host infetti.

Segnali di iniziazione specifici possono anche essere richiesto per la traduzione efficace delle sequenze di acidi nucleici codificanti isolate rivendicati. Questi segnali includono il codone di inizio ATG e le sequenze adiacenti. Segnali esogeni di controllo traslazionale, tra cui il codone di inizio ATG, possono inoltre essere necessario fornire. Uno di abilità ordinaria nell'arte sarebbe facilmente essere in grado di determinare questa necessità e fornire i segnali necessari. E 'ben noto che i codone di iniziazione deve essere in-frame (o in fase) con il quadro di lettura della sequenza codificante desiderata per assicurare traduzione dell'intero inserto. Questi segnali di controllo traslazionale esogeni e codoni di iniziazione sono opzionalmente di una varietà di origine, sia naturali che sintetici. L'efficienza di espressione è eventualmente rafforzata con l'inserimento di opportuni elementi trascrizione enhancer o terminatori di trascrizione.

In espressione eucariotica, uno sarà anche in genere il desiderio di incorporare all'interno dell'unità trascrizionale un sito di poliadenilazione appropriata se uno non era contenuta all'interno del segmento originale clonato. Tipicamente, il poli A Sito Inoltre è posto su 30 e 2000 nucleotidi "a valle" del sito di terminazione della proteina in una posizione prima della terminazione della trascrizione.

Per lungo termine, la produzione ad alta resa di proteine ricombinanti, espressione stabile è preferito. Ad esempio, le linee cellulari che esprimono stabilmente costrutti codificanti per proteine sono progettati. Invece di utilizzare vettori di espressione che contengono origini di replicazione virale, cellule ospiti sono preferibilmente trasformate con vettori controllati da elementi di espressione appropriata di controllo (ad esempio, promoter, enhancer, sequenze, terminatori di trascrizione, siti di poliadenilazione, ecc), e un marcatore selezionabile. Dopo l'introduzione di DNA estraneo, le cellule ingegnerizzate possono essere autorizzati a crescere per 1-2 giorni in un mezzo arricchito, e poi sono passato a un terreno selettivo. Il marcatore selezionabile nel plasmide ricombinante conferisce resistenza alla selezione e permette alle cellule di integrare stabilmente il plasmide nei loro cromosomi e crescono a formare foci, che a sua volta può essere clonato e ampliato in linee cellulari.

Un certo numero di sistemi di selezione sono indicativamente utilizzati, tra cui, ma non limitato, ai geni herpes simplex virus timidina chinasi, fosforibosiltransferasi ipoxantina-guanina e adenina fosforibosiltransferasi, in TK-, cellule hgprt- o aprt- rispettivamente. Inoltre, la resistenza antimetabolita è opzionalmente utilizzato come base di selezione per DHFR, che conferisce resistenza al metotressato; gpt, che conferisce resistenza ad acido micofenolico; neo, che conferisce resistenza alla aminoglicosidi G-418; e igrometrico, che conferisce resistenza alla igromicina. È noto che numerosi altri sistemi di selezione sono noti nella tecnica che sono similmente azionabili nella presente invenzione.

Gli acidi nucleici che codificano i peptidi e polipeptidi della presente invenzione sono facoltativamente somministrati come vaccini acidi nucleici. Ai fini della consegna del vaccino, un acido nucleico che codifica per un peptide o polipeptide della presente invenzione è preferibilmente in un vettore di espressione che comprende l'acido nucleico virale tra cui, ma non limitato a, virus vaccino, adenovirus, retrovirus e / o adeno-associato virus nucleico acido. L'acido nucleico o un vettore di questa invenzione è eventualmente in un liposoma o di un veicolo di consegna che può essere occupato da una cella di via mediata da recettori o altro tipo di endocitosi. I vaccini di acido nucleico della presente invenzione sono preferibilmente in un veicolo farmaceuticamente accettabile o somministrati con un adiuvante. Gli acidi nucleici che codificano i peptidi e polipeptidi della presente invenzione possono anche essere somministrati alle cellule in vivo o ex vivo.

È previsto che gli acidi nucleici isolati dalla pubblicazione sono opzionalmente "overexpressed", cioè, espressa in un aumento dei livelli relativi alla sua naturale espressione in cellule del suo organismo indigena, o anche relativi alla espressione di altre proteine della cellula ospite ricombinante. Tale sovraespressione è valutata da una varietà di metodi indicativamente compresa la radio-etichettatura e / o purificazione della proteina. Tuttavia, metodi semplici e dirette sono preferibili, per esempio, quelli che coinvolgono SDS / PAGE e colorazione delle proteine o immunoblotting, seguita da analisi quantitative, come la scansione densitometrica dei gel risultante o blot. Un aumento specifico nel livello della proteina ricombinante o peptide rispetto al livello naturale in cellule trasfettate è indicativa di sovraespressione, come è abbondanza relativa della proteina specifica rispetto alle altre proteine prodotte dalla cellula ospite e, per esempio , visibili su un gel.

Diversi vettori eterologhi sono descritti per le vaccinazioni del DNA contro le infezioni virali. Per esempio, i vettori descritti nei seguenti riferimenti, integrato qui per riferimento, possono essere utilizzati per esprimere sequenze hEbola posto delle sequenze dei virus o altri patogeni descritti;in particolare, i vettori descritti per il virus dell'epatite B (Michel, ML et al, 1995, immunizzazione DAN-mediata al dell'epatite B antigene di superficie nei topi:... Aspetti della risposta umorale mimica epatite B virale negli esseri umani, Proc Natl Aca .. Sci USA 92:.. 5307-5311; Davis, HL et al, 1993, immunizzazione basata sul DNA induce la secrezione continua di antigene di superficie dell'epatite B e alti livelli di anticorpi circolanti, umano Molec Genetica 2: 1847-1851), l'HIV ..... virus (Wang, B. et al, 1993, Gene inoculazione genera risposte immunitarie contro il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1, Proc Natl Acad Sci USA 90: 4156-4160; Lu, S. et al, 1996, Simian. . virus dell'immunodeficienza sperimentazione vaccino a DNA in Macques, J. Virol 70: 3978-3991; Letvin, NL et al, 1997, potenti risposte immunitarie, protezione anti-HIV generati da bimodale HIV busta DNA più vaccinazione proteine, Proc Natl Acad Sci USA. . 94 (17): 9378-83), e virus influenzali (Robinson, HL et al, 1993, Protezione contro una sfida virus influenzale letale da immunizzazione con un plasmide DNA-emoagglutinina esprimere, Vaccine 11:. 957-960; Ulmer, JB et al, protezione eterologa contro l'influenza mediante iniezione di DNA che codifica una proteina virale, Science 259:.. 1745-1749), così come le infezioni batteriche, come la tubercolosi (Tascon, RE et al, 1996, La vaccinazione contro la tubercolosi mediante iniezione di DNA, Nature Med 2:. 888-892; Huygen, K. et al, 1996, immunogenicità ed efficacia protettiva di un vaccino contro la tubercolosi DNA, Nature Med, 2: 893-898), e infezioni parassitarie, come ad esempio.. malaria (Sedegah, M., 1994 Protezione contro la malaria mediante immunizzazione con proteine plasmide codificante del DNA circumsporozoita, Proc Natl Acad Sci USA 91:.... 9866-9870; Doolan, DL et al, 1996, Aggira restrizione genetica di protezione. contro la malaria con immunizzazione multigene DNA:... CD8 + T .delta cellule-interferone, e nitrico immunità ossido-dipendente, J. esperienza fumi Med, 1183: 1739-1746).

Molti metodi sono facoltativamente utilizzati per introdurre le formulazioni di vaccino sopra descritti. Questi includono, ma non sono limitati a, orale, intradermica, intramuscolare, intraperitoneale, endovenosa, sottocutanea, e percorsi intranasale. In alternativa, in una realizzazione preferita è introdotto il vaccino virus chimerico per via naturale di infezione del patogeno per cui il vaccino è stato progettato. I vaccini a DNA della presente invenzione sono eventualmente somministrati in soluzioni saline da iniezioni nel muscolo o pelle con una siringa e ago (Wolff JA et al, 1990, il trasferimento genico diretto nel muscolo topo in vivo, Science 247:. 1465-1468; Raz , E., 1994 intradermico gene immunizzazione:.... Il possibile ruolo di assorbimento del DNA nella induzione di immunità cellulare ai virus, c Natl Acd Sci USA 91: 9519-9523). Un altro modo di amministrare vaccini a DNA presente operabile viene chiamato il metodo "gene gun", per cui oro perline microscopiche rivestiti con le molecole di DNA di interesse è licenziato in cellule (Tang, D. et al., 1992, immunizzazione genetica è un metodo semplice per suscitare una risposta immunitaria, Nature 356: 152-154). Per le altre recensioni dei metodi per vaccini a DNA, vedi Robinson, HL 1999, vaccini a DNA: meccanismo di base e le risposte immunitarie (Review), int. J. Mol. Med. 4 (5): 549-555; Barber, B., 1997, Introduzione: emergenti strategie vaccinali, Seminari in Immunologia 9 (5): 269-270; . ed Robinson, HL et al, 1997, vaccini a DNA, Seminari in Immunologia 9 (5): 271-283.

Attenuazione di hEbola virus o relative varianti

Il virus hEbola o loro varianti dell'invenzione sono eventualmente geneticamente ingegnerizzati per mostrare un fenotipo attenuato. In particolare, i virus dell'invenzione esibiscono un fenotipo attenuato in un soggetto a cui il virus viene somministrato come vaccino. L'attenuazione può essere ottenuta con qualsiasi metodo noto ad un tecnico esperto. Senza essere vincolati dalla teoria, il fenotipo attenuato del virus del trovato è causata, ad esempio, utilizzando un virus che naturalmente non si replica bene in una specie host di destinazione, per esempio, dalla replica ridotta del genoma virale, da ridotta capacità del virus di infettare una cellula ospite, o da una ridotta capacità delle proteine virali per assemblare un infettiva particella virale relativa alla specie tipo selvaggio del virus.

I fenotipi attenuati del virus hEbola o varianti di essi siano eventualmente testati con qualsiasi metodo conosciuto per l'artigiano. Un virus candidato, per esempio, è opzionalmente testato per la sua capacità di infettare un ospite o per il tasso di replicazione in un sistema di coltura cellulare. In alcune forme di realizzazione, le curve di crescita a diverse temperature sono usati per testare il fenotipo attenuato del virus. Ad esempio, un virus attenuato è in grado di crescere a 35 ° C, ma non a 39 ° C o 40 ° C. In alcune forme di realizzazione, differenti linee cellulari sono utilizzati per valutare il fenotipo attenuato del virus. Ad esempio, un virus attenuato può essere solo in grado di crescere in linee cellulari di scimmia, ma non le linee di cellule umane, oppure i titoli virus realizzabili in diverse linee cellulari sono diversi per il virus attenuato. In alcune forme di realizzazione, la replicazione virale nel tratto respiratorio di un piccolo modello animale, inclusi ma non limitati a, criceti, ratti, topi cotone e porcellini d'India, viene utilizzato per valutare i fenotipi attenuati del virus. In altre forme di realizzazione, la risposta immunitaria indotta dal virus, compreso ma non limitato a, i titoli anticorpali (ad esempio, dosati con riduzione di neutralizzazione delle placche test o ELISA) viene utilizzata per valutare i fenotipi attenuati del virus. In una forma specifica, la riduzione di neutralizzazione delle placche test ELISA o viene effettuato con una dose bassa. In alcune forme di realizzazione, la capacità del virus hEbola di suscitare sintomi patologici in un modello animale è testato. Una ridotta capacità del virus di suscitare i sintomi patologici in un sistema modello animale è indicativo del suo fenotipo attenuato. In una forma di realizzazione specifica, i virus candidati vengono testati in un modello scimmia per l'infezione nasale, indicato dalla produzione di muco.

I virus dell'invenzione sono opzionalmente attenuati in modo tale che una o più delle caratteristiche funzionali del virus sono svalutati. In alcune forme di realizzazione, l'attenuazione è misurata rispetto alla specie tipo selvaggio del virus da cui il virus attenuato è derivato. In altre forme di realizzazione, l'attenuazione è determinata confrontando la crescita di un virus attenuato in sistemi host diversi. Così, per esempio non limitativo, virus hEbola o una sua variante è attenuato quando coltivato in un ospite umano se la crescita del hEbola o variante della stessa nell'ospite umano è ridotto rispetto al non attenuato hEbola o variante della stessa.

In alcune forme di realizzazione, il virus attenuato dell'invenzione è in grado di infettare un ospite, è in grado di replicare in un ospite tale che le particelle virali infettive sono prodotte. Rispetto alle specie wild type, tuttavia, la specie attenuati cresce per abbassare titoli o cresce più lentamente.Qualsiasi tecnica nota al tecnico esperto può essere utilizzata per determinare la curva di crescita del virus attenuato e confrontarlo con la curva di crescita del virus wild-type.

In alcune forme di realizzazione, il virus attenuato dell'invenzione (ad esempio, un hEbola ricombinante o chimerica) non può replicarsi nelle cellule umani nonché il virus wild type (es, tipo selvaggio hEbola) fa. Tuttavia, il virus attenuato può replicare bene in una linea cellulare che manca di funzioni interferone, quali cellule Vero.

In altre forme di realizzazione, il virus attenuato dell'invenzione è in grado di infettare un ospite, di replicare nell'ospite e di causare proteine del virus del trovato per essere inserito nella membrana citoplasmatica, ma il virus attenuato non provoca l'host per produrre nuove particelle virali infettive. In alcune forme di realizzazione, il virus attenuato infetta l'ospite, replica nell'ospite, e fa sì che le proteine virali da inserire nella membrana citoplasmatica dell'ospite con la stessa efficienza come il tipo selvaggio hEbola. In altre forme di realizzazione, la capacità del virus attenuato per causare proteine virali da inserire nella membrana citoplasmatica nella cellula ospite è ridotto rispetto al virus di tipo selvaggio. In alcune forme di realizzazione, la capacità del virus attenuato hEbola di replicare nel host è ridotto rispetto al virus wild-type. Qualsiasi tecnica nota al tecnico esperto può essere utilizzato per determinare se un virus è in grado di infettare una cellula di mammifero, di replicarsi nell'ospite e di causare proteine virali da inserire nella membrana citoplasmatica dell'ospite.

In alcune forme di realizzazione, il virus attenuato dell'invenzione è in grado di infettare un ospite.In contrasto con il tipo selvatico hEbola, tuttavia, il hEbola attenuato può non essere replicato nell'ospite. In una forma specifica, il virus attenuato hEbola può infettare un host e può causare l'host di inserire proteine virali nelle sue membrane citoplasmatiche, ma il virus attenuato non è in grado di essere replicato nell'ospite. Qualsiasi metodo noto al bravo artigiano può essere utilizzato per verificare se la hEbola attenuato ha infettato l'ospite e ha causato l'host di inserire proteine virali nelle sue membrane citoplasmatiche.

In alcune forme di realizzazione, la capacità del virus attenuato per infettare un host è ridotta rispetto alla capacità del virus di tipo selvatico per infettare stesso host. Qualsiasi tecnica conosciuta per l'artigiano esperto può essere utilizzato per determinare se un virus è in grado di infettare un host.

In alcune forme di realizzazione, mutazioni (ad esempio, mutazioni missense) vengono introdotti nel genoma del virus, per esempio, nella sequenza di SEQ ID NOs: 1 o 10, o per generare un virus con un fenotipo attenuato. Mutazioni (ad esempio, mutazioni missense) possono essere introdotti nei geni strutturali e / o di geni regolatori del hEbola. Le mutazioni sono aggiunte facoltativamente, sostituzioni, delezioni, o loro combinazioni. Tale variante hEbola può essere sottoposti a screening per una funzionalità prevista, come infettività, la capacità di replica, capacità di sintesi proteica, assemblaggio capacità, così come effetto citopatico in colture cellulari. In una forma di realizzazione specifica, la mutazione di senso è una mutazione sensibile a freddo. In un'altra forma di realizzazione, la mutazione è una mutazione missenso termosensibile. In un'altra forma di realizzazione, la mutazione di senso impedisce una normale lavorazione o scissione delle proteine virali.

In altre forme di realizzazione, delezioni sono introdotti nel genoma del virus hEbola, che determinano l'attenuazione del virus.

In alcune forme di realizzazione, l'attenuazione del virus viene ottenuto sostituendo un gene del virus wild type con un gene di un virus di una specie differente, di un sottogruppo differente, o di una variante diversa. In un altro aspetto, l'attenuazione del virus viene ottenuto sostituendo uno o più specifici domini di una proteina del virus wild type con domini derivate dalla corrispondente proteina di un virus di una specie differente. In alcune altre forme di realizzazione, l'attenuazione del virus si ottiene eliminando uno o più specifici domini di una proteina del virus wild-type.

Quando viene utilizzato un vaccino vivo attenuato, la sua sicurezza dovrebbe essere considerato.Il vaccino, preferibilmente non causa la malattia. Eventuali tecniche note nell'arte per migliorare la sicurezza del vaccino sono azionabili nella presente invenzione. Oltre alle tecniche di attenuazione, vengono opzionalmente essere usate altre tecniche. Un esempio non limitativo, è quello di utilizzare un gene eterologo solubile che non può essere incorporato nella membrana virione. Ad esempio, viene utilizzata una sola copia della versione solubile di una proteina transmembrana virale mancano i domini transmembrana e citosolici della stessa.

I vari dosaggi vengano eventualmente utilizzati per testare la sicurezza di un vaccino. Ad esempio, gradienti di saccarosio e saggi di neutralizzazione sono usati per testare la sicurezza.Un test gradiente di saccarosio è opzionalmente utilizzato per determinare se una proteina eterologa è inserito in un virione. Se la proteina eterologa è inserito nel virione, il virione è preferibilmente testato per la sua capacità di provocare sintomi in un modello animale appropriato, in quanto il virus può aver acquisito nuovo, possibilmente patologica, proprietà.

5.4 coadiuvanti e Carrier Molecole

hEbola antigeni associati vengono somministrati con uno o più adiuvanti. In una forma di realizzazione, l'antigene hEbola-associato viene somministrato insieme ad adiuvanti di sali minerali o sali minerali gel adiuvante. Tali sali minerali e minerali coadiuvanti gel sale includono, ma non sono limitati a, idrossido di alluminio (ALHYDROGEL, REHYDRAGEL), gel fosfato di alluminio, alluminio idrossifosfato (ADJU-PHOS), e fosfato di calcio.

In un'altra forma di realizzazione, l'antigene hEbola-associato viene somministrato con un adiuvante immunostimolante. Tale classe di adiuvanti includono, ma non sono limitati a, citochine (ad esempio, l'interleuchina-2, interleuchina-7, interleuchina-12, fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF), interferone-γ interleuchina-1β (IL-1β ), e IL-1β peptide o Sclavo Peptide), liposomi-citochine contenenti glicosidi, saponine triterpeniche o (ad esempio, quila e QS-21, venduto anche con il marchio STIMULON, ISCOPREP), muramil Dipeptide (MDP) derivati, come ad esempio N -acetyl-muramil-L-threonyl-D-isoglutamine (Threonyl-MDP, venduto con il marchio di fabbrica TERMURTIDE), GMDP, N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamine, N-acetylmuramyl-L-alanyl- D-isoglutaminyl-L-alanina-2 (1'-2'-dipalmitoil-sn-glycero-3-idrossi phosphoryloxy) -ethylamine, muramil tripeptide fosfatidiletanolamina (MTP-PE), non metilato dinucleotides e oligonucleotidi CpG, come il DNA batterico e loro frammenti, LPS, monofosforil lipide A (3D-MLA venduti con il marchio MPL), e polifosfazeni.

In un'altra forma di realizzazione, l'adiuvante utilizzato è un particolare adiuvante, tra cui, ma non limitato a, emulsioni, ad esempio, adiuvante completo di Freund, di Freund Incompleto adiuvante, lo squalene o formulazioni adiuvanti Squalano olio-in-acqua, come SAF e MF59, ad esempio, preparato con blocchi copolimeri, come L-121 (poliossipropilene / polyoxyetheylene) venduti sotto il marchio Pluronic L-121, liposomi, virosomi, cochleates, e complesso stimolante immunitario, che è venduto con il marchio ISCOM.

In un'altra forma di realizzazione, viene usato un adiuvante microparticular. Coadiuvanti Microparticular includono, ma non sono limitati a, poliesteri biodegradabili e biocompatibili, omo e copolimeri di acido lattico (PLA) e acido glicolico (PGA), poli (lattide-co-glicolidi) (PLGA) microparticelle, polimeri auto-associato in particelle (particelle poloxamer), polimeri solubili (polifosfazeni), e particelle virus-simili (VLP) come particelle di proteine ricombinanti, ad esempio, l'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg).

Ancora un'altra classe di adiuvanti che vengono eventualmente utilizzati includono adiuvanti mucosali, incluso ma non limitato a termolabile enterotossina da Escherichia coli (LT), colera holotoxin (CT) e la subunità B della tossina del colera (CTB) da Vibrio cholerae , tossine mutanti (ad esempio, , LTK63 e LTR72), microparticelle, liposomi e polimerizzati.

In altre forme di realizzazione, una delle classi sopra di adiuvanti sono opzionalmente utilizzata in combinazione tra loro o con altri adiuvanti. Ad esempio, non limitativo esempi di preparazioni adiuvanti combinazione utilizzati per gestire gli antigeni hEbola associati dell'invenzione comprendono liposomi contenenti proteine immunostimolante, citochine, cellule T e / o peptidi cellule B, o microbi con o senza intrappolata IL-2 o microparticelle contenenti enterotossina. Altri coadiuvanti noti nell'arte sono incluse nel campo di applicazione dell'invenzione (vedi Vaccino Design:.. Subunità e approccio adiuvante, Cap 7, Michael F. Powell e Mark J. Newman (a cura di), Plenum Press, New York, 1995, che è incorporata nella sua interezza).

L'efficacia di un adiuvante è illustratively determinata misurando l'induzione di anticorpi diretti contro un polipeptide immunogenico contenente un polipeptide epitopo hEbola, gli anticorpi derivanti dalla somministrazione di questo polipeptide nei vaccini che sono anche composti da vari coadiuvanti.

I polipeptidi sono eventualmente formulati nel vaccino come forme neutre o sale. Sali farmaceuticamente accettabili includono i sali acidi supplementari (formati con i gruppi amminici liberi del peptide) e che sono formati con acidi inorganici, quali, ad esempio, acido cloridrico o fosforico o acidi organici come acetico, ossalico, tartarico, maleico, e simili. Sali formati con gruppi carbossilici liberi sono opzionalmente derivati da basi inorganiche, quali, ad esempio, sodio potassio, ammonio, calcio, o idrossidi di ferro, e basi organiche quali isopropilammina, trimetilammina, 2-etanolo ethylamino, istidina, procaina e simili .

I vaccini dell'invenzione sono preferibilmente polivalente o monovalente. Vaccini polivalenti sono costituiti da virus ricombinanti che dirigono l'espressione di più di un antigene.

Molti metodi sono qui azionabili per introdurre le formulazioni di vaccino dell'invenzione; questi includono ma non sono limitati a orale, intradermica, intramuscolare, intraperitoneale, endovenosa, sottocutanea, itinerari intranasale, e via scarificazione (graffiare attraverso gli strati superiori della pelle, ad esempio, utilizzando un ago biforcato).

Il paziente a cui il vaccino viene somministrato è preferibilmente un mammifero, più preferibilmente un umano, ma è anche opzionalmente un animale non umano compreso ma non limitato ai primati inferiori, mucche, cavalli, pecore, maiali, pollame (ad esempio, polli), capre, gatti, cani, criceti, topi e ratti.

Preparazione di anticorpi

Gli anticorpi che riconoscono specificamente un polipeptide dell'invenzione, quali, ma non limitatamente a, polipeptidi, tra cui la sequenza di SEQ ID Nn 2-9, 59, o 11-19 e altri polipeptidi come descritto nel presente documento, o hEbola epitopo o antigene loro frammenti leganti sono utilizzati in una forma preferita per la rilevazione, lo screening, e isolando il polipeptide dell'invenzione o loro frammenti, o sequenze simili che possono codificare enzimi simili dagli altri organismi. Ad esempio, in una forma di realizzazione specifica, un anticorpo che si lega immunospecifically hEbola epitopo, o un suo frammento, viene utilizzato per vari metodi di rilevamento in vitro, compresi saggi immunoenzimatici (ELISA), test radioimmunologico, western blot, ecc, per l' rilevamento di un polipeptide dell'invenzione o, preferibilmente, hEbola, in campioni, per esempio, un materiale biologico, comprese le cellule, cellule di coltura (per esempio su supporti batterica colture cellulari, colture cellulari di mammifero supporti, insetto mezzi di coltura cellulare, coltura di cellule di lievito media, ecc), sangue, plasma, siero, tessuti, espettorato, aspirati naseopharyngeal, ecc

Anticorpi specifici per un polipeptide dell'invenzione o qualsiasi epitopo di hEbola sono facoltativamente generati con qualsiasi metodo adatto noto nella tecnica. Anticorpi policlonali ad un antigene di interesse, per esempio, il virus hEbola dalla cassetta adesione No. 200706291, o comprendente una sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10, sono eventualmente prodotta da varie procedure ben note nell'arte. Ad esempio, un antigene viene opzionalmente somministrato a vari animali ospiti, tra cui, ma non limitato a, conigli, topi, ratti, ecc, per indurre la produzione di antisieri contenenti anticorpi policlonali specifici per l'antigene. Vari coadiuvanti sono opzionalmente utilizzati per aumentare la risposta immunitaria, a seconda delle specie ospite, e comprendono ma non sono limitati a, Freund di (completa e incompleta) adiuvante, gel minerali come idrossido di alluminio, superficie sostanze attive, come lisolecitina, polioli Pluronic, polianioni, peptidi, emulsioni oleose, hemocyanins patelle buco della serratura, dinitrofenolo, e coadiuvanti potenzialmente utili per gli esseri umani, quali BCG (Bacillo Calmette-Guerin) eCorynebacterium parvum . Tali adiuvanti sono anche ben noti nell'arte.

Gli anticorpi monoclonali sono opzionalmente preparati utilizzando una varietà di tecniche note nell'arte compreso l'impiego di ibridomi, ricombinante, e tecnologie di visualizzazione del fago, o una loro combinazione. In un esempio, gli anticorpi monoclonali sono prodotti con tecniche ibridomi compresi quelli noti nell'arte e insegnato, per esempio, in Harlow et al, Anticorpi: Un manuale di laboratorio;. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed 1988.) Hammerling, et al, in:. Anticorpi monoclonali e T-Cell ibridomi, pp 563-681 (Elsevier, NY, 1981) (entrambi i quali sono incorporati per riferimento nel loro entireties).. Il termine "anticorpo monoclonale" qui utilizzato non è limitato alle anticorpi prodotti attraverso la tecnologia degli ibridomi. Il termine "anticorpo monoclonale" si riferisce ad un anticorpo derivato da un singolo clone, compreso qualsiasi eucariote, procariote, o fago clone, e non il metodo con cui viene prodotto.

Metodi per la produzione e lo screening per gli anticorpi specifici che utilizzano la tecnologia degli ibridomi sono di routine e ben noto nella tecnica. In un esempio non limitativo, i topi sono immunizzati con un antigene di interesse o una cellula che esprime un tale antigene. Quando viene rilevata una risposta immunitaria, ad esempio, gli anticorpi specifici per l'antigene vengono rilevati nel siero di topo, la milza mouse viene raccolto e splenociti isolati. Gli splenociti sono poi fusi con tecniche ben note a tutte le cellule del mieloma adatti. Ibridomi vengono selezionati e clonati limitando la diluizione. I cloni ibridomi sono quindi dosati con metodi noti nell'arte per le cellule che secernono anticorpi in grado di legare l'antigene. Liquido ascitico, che generalmente contiene alti livelli di anticorpi, viene eventualmente generato inoculando topi per via intraperitoneale con cloni ibridomi positivi.

Frammenti di anticorpi che riconoscono epitopi specifici sono eventualmente generati da tecniche note. Ad esempio, Fab e F (ab ') 2 frammenti sono indicativamente prodotte da clivaggio proteolitico di molecole di immunoglobulina, utilizzando enzimi come la papaina (per produrre frammenti Fab) o pepsina (per produrre F (ab ') 2 frammenti). F (ab ') 2 frammenti contengono preferibilmente la catena leggera e la regione variabile, la regione CH1 e la regione cerniera della catena pesante.

Gli anticorpi dell'invenzione o loro frammenti sono eventualmente prodotte con qualsiasi metodo noto nell'arte per la sintesi di anticorpi, in particolare, mediante sintesi chimica o, preferibilmente, mediante tecniche di espressione ricombinanti.

La sequenza nucleotidica codificante un anticorpo è ottenuto dalle informazioni disponibili agli esperti del ramo (ad esempio, da GenBank, la letteratura, o per clonazione di routine e analisi di sequenza). Se un clone contenente un acido nucleico che codifica un particolare anticorpo o un frammento-epitopo vincolante dello stesso non è disponibile, ma la sequenza della molecola di anticorpo o-epitopo vincolante suo frammento è noto, un acido nucleico codificante la immunoglobulina può essere sintetizzato chimicamente o ottenuta da una fonte appropriata (ad esempio, una libreria di cDNA anticorpo, o una libreria di cDNA generato da, o acido nucleico, preferibilmente poli A + RNA isolato da qualsiasi tessuto o cellule che esprimono l'anticorpo, come ibridomi selezionati per esprimere un anticorpo) da amplificazione PCR utilizzando primers sintetici hybridizable al 3 'e 5' estremità della sequenza o clonando utilizzando un oligonucleotide sonda specifica per la particolare sequenza genica per identificare, ad esempio, un clone di cDNA da una libreria di cDNA che codifica l'anticorpo. Acidi nucleici amplificati generati dalla PCR vengono eventualmente poi clonati in vettori di clonazione replicabili utilizzando qualsiasi metodo noto nell'arte.

Una volta che la sequenza nucleotidica dell'anticorpo è determinata la sequenza nucleotidica del anticorpo è opzionalmente manipolato utilizzando metodi ben noti nell'arte per la manipolazione di sequenze nucleotidiche, ad esempio, tecniche di DNA ricombinante, mutagenesi sito-specifica, PCR, ecc (vedi, per esempio, le tecniche descritte in Sambrook et al, supra,... ed Ausubel et al, eds, 1998 protocolli attuali in Biologia Molecolare, John Wiley & Sons, NY, che sono entrambi incorporati mediante riferimento nei loro entireties), per generare anticorpi avente una sequenza amminoacidica diversa da, per esempio, l'introduzione di sostituzioni amminoacidiche, delezioni e / o inserzioni nelle-epitopi di legame regioni dominio dei anticorpi o qualsiasi parte di anticorpi che possono aumentare o ridurre le attività biologiche degli anticorpi .

Espressione ricombinante di un anticorpo richiede la costruzione di un vettore di espressione contenente una sequenza nucleotidica che codifica l'anticorpo. Una volta che una sequenza nucleotidica che codifica una molecola di anticorpo o una catena pesante o leggera di un anticorpo, o parte di esso è stato ottenuto, il vettore per la produzione della molecola anticorpale è opzionalmente prodotta mediante la tecnologia del DNA ricombinante utilizzando tecniche note nella tecnica come descritto in sezioni precedenti. Metodi che sono noti agli esperti del ramo vengono opzionalmente usati per costruire vettori di espressione contenenti sequenze che codificano anticorpo adatto trascrizionale e segnali di controllo traslazionale. Questi metodi includono, per esempio, tecniche di DNA ricombinante in vitro, tecniche sintetiche, e in vivo ricombinazione genetica. La sequenza nucleotidica codificante la regione variabile pesante catena, catene leggere regione variabile, sia per le pesanti catene e di luce-catena regioni variabili, un frammento-epitopo vincolante della regione variabile pesante di e / o luce-catena, o di uno o più regioni che determinano la complementarità (CDR) di un anticorpo sono opzionalmente clonati in un tale vettore per l'espressione. Così, vettore di espressione preparata viene opzionalmente poi introdotto in cellule ospiti appropriate per l'espressione dell'anticorpo. Di conseguenza, l'invenzione include cellule ospiti che contengono un polinucleotide che codifica un anticorpo specifico per i polipeptidi dell'invenzione o loro frammenti.

La cellula ospite è opzionalmente co-trasfettate con due vettori di espressione dell'invenzione, il primo vettore che codifica un polipeptide a catena pesante derivato e il secondo vettore che codifica un polipeptide derivato catena leggera. I due vettori contengono illustratively marcatori selezionabili identiche che consentono la parità di espressione di polipeptidi a catena pesante e leggera o diversi marcatori selezionabili per garantire la manutenzione di entrambi i plasmidi. In alternativa, un singolo vettore viene opzionalmente usata che codifica, ed è capace di esprimere, sia polipeptidi catene pesanti e leggere. In tali situazioni, la catena leggera deve essere collocato prima della catena pesante, per evitare un eccesso di sostanze tossiche catena pesante libero (Proudfoot, Nature, 322: 52, 1986; ed Kohler, Proc Natl Acad Sci USA, 77: 2.... 197, 1980). Le sequenze codificanti per le catene pesanti e leggere opzionalmente includono cDNA o DNA genomico.

In un'altra forma di realizzazione, gli anticorpi sono generati utilizzando vari metodi phage display noti nell'arte. In modalità di visualizzazione dei fagi, domini anticorpali funzionali vengono visualizzati sulla superficie delle particelle fagiche che portano le loro sequenze polinucleotidiche codificanti. In una particolare forma di realizzazione, tale fago viene utilizzato per visualizzare antigene domini di legame, come Fab e Fv o disolfuro-legame stabilizzati Fv, espresse da un repertorio o una libreria di anticorpi combinatoria (ad esempio, umano o murino). Phage esprimere un dominio di legame antigene che lega l'antigene di interesse è opzionalmente selezionato o identificato con l'antigene, ad esempio, utilizzando l'antigene o antigeni legati o catturati per una superficie solida o tallone etichettati. Fagi utilizzati in questi metodi sono tipicamente fago filamentoso, tra cui fd e M13. I domini legame antigene sono espressi come una proteina ricombinante fuso a uno proteina gene fago III o gene VIII. Esempi di metodi di phage display che possono essere utilizzati per rendere le immunoglobuline, o loro frammenti, secondo la presente invenzione includono quelli descritti in Brinkman et al., J. Immunol. Metodi, 182: 41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Metodi, 184: 177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol, 24: 952-958, 1994;. Persico et al, Gene, 187: 9-18, 1997;. . Burton et al, Advances in Immunologia, 57: 191-280, 1994; PCT applicazione No. PCT / GB91 / 01134; Pubblicazioni PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e US Pat. Nos 5.698.426.; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753;5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108;ciascuno dei quali è qui incorporato per riferimento nella sua interezza.

Come descritto nei riferimenti di cui sopra, dopo la selezione dei fagi, l'anticorpo regioni codificanti del fago è opzionalmente isolata e utilizzato per generare anticorpi interi, compresi anticorpi umani, o altri frammenti desiderati, ed espressa in ogni host desiderato, comprese le cellule di mammiferi, insetti cellule, cellule vegetali, lieviti e batteri, ad esempio, come descritto in dettaglio di seguito. Ad esempio, le tecniche per la produzione ricombinante Fab, Fab 'e F (ab') 2frammenti sono facoltativamente impiegati utilizzando metodi noti nell'arte come quelli descritti nella pubblicazione PCT WO 92/22324; Mullinax et al, BioTechniques, 12 (6):. 864-869, 1992; e Sawai et al, AJR1, 34:. 26-34, 1995; . ed Meglio et al, Science, 240: 1041-1043, 1988 (ciascuno dei quali è inclusa per riferimento nella sua interezza). Esempi di tecniche atti a produrre catena singola fvs e anticorpi includono quelli descritti in US Pat. Nn 4.946.778 e 5.258.498.; Huston et al, Metodi di Enzimologia, 203: 46-88, 1991;. Shu et al, PNAS, 90:. 7995-7999, 1993; . ed Skerra et al, Science, 240: 1038-1040, 1988.

Una volta che una molecola di anticorpo dell'invenzione è stato prodotto con qualsiasi metodo sopra descritti, o altrimenti noto nella tecnica, è quindi opzionalmente purificato mediante qualsiasi metodo noto nell'arte per la purificazione di una molecola di immunoglobulina, per esempio, mediante cromatografia (ad esempio, scambio ionico, affinità, in particolare affinità per l'antigene specifico dopo Proteina A o proteina G purificazione e dimensionamento cromatografia su colonna), centrifugazione, solubilità differenziale, o con qualsiasi altra tecnica standard (s) per la purificazione di proteine. Inoltre, gli anticorpi della presente invenzione o loro frammenti sono facoltativamente fusi alle sequenze polipeptidiche eterologhe qui descritti o altrimenti noti nell'arte per facilitare la purificazione. Esempi illustrativi includono 6 × sua tag, tag FLAG, biotina, avidina, o altro sistema.

Per alcuni usi, compreso l'uso in vivo di anticorpi negli esseri umani e nei test di rilevazione vitro, è preferibile utilizzare gli anticorpi chimerici, umanizzati o umani. Un anticorpo chimerico è una molecola in cui differenti porzioni di anticorpi sono derivati da diverse specie animali, come gli anticorpi aventi una regione variabile derivata da un anticorpo monoclonale murino e una regione costante derivata da una immunoglobulina umana. Metodi per produrre anticorpi chimerici sono noti nell'arte. Vedere ad esempio, Morrison, Scienza, 229: 1202, 1985; Oi et al, BioTechniques, 4:. 214 1986; Gillies et al., J. Immunol. Metodi, 125: 191-202, 1989; US Pat. Nos 5.807.715.;4.816.567; e 4.816.397, che sono qui incorporati per riferimento nel loro entireties. Gli anticorpi umanizzati sono molecole anticorpali da specie non-umane che legano l'antigene desiderato avere una o più regioni che determinano la complementarità (CDR) dalla specie non umane e regioni quadro di una molecola di immunoglobulina umana. Spesso, i residui quadro nelle regioni di supporto umane saranno sostituiti con il corrispondente residuo della anticorpi donatore CDR di modificare, preferibilmente migliorare, legame antigene. Queste sostituzioni quadro sono identificati con metodi ben noti nell'arte, ad esempio, dalla modellazione delle interazioni del CDR e dei residui quadro per individuare residui quadro importanti per il legame antigene e confronto sequenza per identificare i residui quadro insoliti in posizioni particolari. Vedere, ad esempio, la regina et al., US Pat. No. 5.585.089; Riechmann et al, Nature, 332:. 323, del 1988, che sono qui incorporati per riferimento nel loro entireties. Gli anticorpi sono umanizzato utilizzando una varietà di tecniche note nell'arte tra cui, ad esempio, CDR-innesti (EP 239.400; pubblicazione PCT WO 91/09967; US Pat nn 5.225.539;.. 5.530.101 e 5.585.089), impiallacciatura o resurfacing (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Immunologia Molecolare, 28 (4/5):. 489-498, 1991; Studnicka et al, Proteina Ingegneria, 7 (6):. 805-814, 1994; Roguska et al, Proc Natl Acad.. . Sci USA, 91: 969-973, 1994), e la catena mischiare (US Pat No. 5.565.332), ognuno dei quali sono qui incorporati per riferimento nel loro entireties..

Completamente anticorpi umani sono particolarmente utili per il trattamento terapeutico di pazienti umani. Anticorpi umani sono fatti da una varietà di metodi noti nell'arte indicativamente compresi i metodi di visualizzazione dei fagi descritti sopra utilizzando le librerie di anticorpi derivati da sequenze di immunoglobuline umane. Vedere US Pat. Nn 4.444.887 e 4.716.111.; e pubblicazioni PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096;WO 96/33735; e WO 91/10741, ciascuno dei quali è qui incorporato per riferimento nella sua interezza.

Gli anticorpi umani sono anche illustratively prodotti utilizzando topi transgenici, che sono incapaci di esprimere immunoglobuline endogene funzionali, ma che possono esprimere i geni delle immunoglobuline umane. Per una panoramica di questa tecnologia per la produzione di anticorpi umani, vedere Lonberg e Huszar, Int. Rev. Immunol, 13: 65-93, 1995 Per una discussione dettagliata di questa tecnologia per la produzione di anticorpi umani e anticorpi monoclonali umani e protocolli per la produzione di tali anticorpi, vedi, ad esempio, le pubblicazioni PCT WO 98/24893;. WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Brevetto europeo No. 0 598 877; US Pat. Nos 5.413.923.; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806;5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; e 5.939.598, che sono incorporate per riferimento nel presente documento in loro entireties. Inoltre, aziende come Abgenix, Inc. (Fremont, Calif.), Medarex (NJ) e Genpharm (San Jose, California.) Possono essere impegnati a fornire anticorpi umani diretti contro un antigene selezionato utilizzando una tecnologia simile a quella sopra descritta.

Anticorpi completamente umani che riconoscono un epitopo selezionata vengono eventualmente generati utilizzando una tecnica denominata "selezione guidata." In questo approccio un anticorpo monoclonale selezionato non umano, ad esempio, un anticorpo topo, viene utilizzato per guidare la selezione di un anticorpo completamente umano riconoscendo lo stesso epitopo.(Jespers et al, Bio / tecnologia, 12:. 899-903, 1988).

Anticorpi fuse o coniugati per polipeptidi eterologhi vengono eventualmente utilizzati in dosaggi in vitro e in metodi di purificazione (ad esempio, cromatografia di affinità) noti nell'arte. Vedere ad esempio, PCT WO 93/21232 No. pubblicazione; EP 439.095; Naramura et al., Immunol. Lett, 39: 91-99, 1994;. US Pat. No. 5.474.981; Gillies et al, PNAS, 89:. 1428-1432, 1992; . ed Fell et al, J. Immunol, 146:. 2446-2452, del 1991, che sono qui incorporati per riferimento nel loro entireties.

Gli anticorpi possono anche essere indicativamente montate su supporti solidi, che sono particolarmente utili per saggi immunologici o purificazione dei polipeptidi dell'invenzione o frammenti, derivati, analoghi, o loro varianti o molecole simili aventi le attività enzimatiche simili a quelli del polipeptide dell'invenzione. Tali supporti solidi includono, ma non sono limitati a, vetro, cellulosa, poliacrilammide, nylon, polistirene, cloruro di polivinile o polipropilene.

Composizioni farmaceutiche e kit

La presente invenzione comprende composizioni farmaceutiche inclusi agenti antivirali della presente invenzione. In una forma di realizzazione specifica, l'agente antivirale è preferibilmente un anticorpo che si lega immunospecifically e neutralizza il virus hEbola o sue varianti, o qualsiasi proteine derivate. In un'altra forma di realizzazione specifica, l'agente antivirale è un polipeptide o molecola di acido nucleico dell'invenzione. Le composizioni farmaceutiche hanno utilità come agente profilattico antivirale sono illustratively somministrato ad un soggetto in cui il soggetto è stato esposto o si prevede di essere esposti a un virus.

I vari sistemi di consegna sono conosciuti e atti a gestire la composizione farmaceutica dell'invenzione, indicativamente, incapsulamento in liposomi, microparticelle, microcapsule, le cellule ricombinanti in grado di esprimere i virus mutanti, e endocitosi mediata da recettori (vedi, ad esempio, Wu e Wu, 1987 . J. Biol Chem 262:. 4429 4432). Metodi di introduzione includono ma non sono limitati a intradermica, intramuscolare, intraperitoneale, endovenosa, sottocutanea, intranasale, epidurale, e via orale. I composti possono essere somministrati in qualsiasi forma conveniente, per esempio mediante infusione o iniezione di bolo, per assorbimento attraverso rivestimenti epiteliali o mucocutanee (ad esempio, mucosa orale, mucosa rettale e intestinale, ecc) e facoltativamente somministrati insieme ad altri agenti biologicamente attivi.L'amministrazione è sistemica o locale. In una forma di realizzazione preferita, è opportuno introdurre le composizioni farmaceutiche dell'invenzione nei polmoni da qualsiasi percorso adatto.Somministrazione polmonare può anche essere impiegato, ad esempio, mediante l'uso di un inalatore o nebulizzatore, e la formulazione con un agente aerosolizing.

In una forma di realizzazione specifica, è opportuno somministrare le composizioni farmaceutiche dell'invenzione localmente alla zona bisogno di un trattamento. Tale somministrazione può essere ottenuto, per esempio, e non a titolo di limitazione, l'infusione locale durante l'intervento, l'applicazione topica, ad esempio, in combinazione con una medicazione dopo l'intervento chirurgico, per iniezione, mediante un catetere, per mezzo di una supposta , mediante spray nasale, o per mezzo di un impianto, l'impianto essendo di un materiale poroso, non poroso, o gelatinoso, comprese le membrane, come membrane sialastic, o fibre. In una forma di realizzazione, l'amministrazione può essere per iniezione diretta nel sito (o ex sito) tessuti infetti.

In un'altra forma di realizzazione, la composizione farmaceutica viene consegnato in una vescicola, in particolare un liposomi (vedi Langer 1990, Science 249: 1527-1533; Trattare et al, in liposomi nella terapia di malattie infettive e il cancro, Lopez Berestein e Fidler. (eds.), Liss, New York, pp 353-365 (1989);. Lopez-Berestein, ibidem, pp 317-327;... vedere generalmente Ibid).

In un'altra forma di realizzazione, la composizione farmaceutica viene fornito in un sistema a rilascio controllato. In una forma di realizzazione, viene utilizzata una pompa (vedi Langer, supra, Sefton, 1987 CRC Crit Rif Biomed Eng 14:..... 201; Buchwald et al, 1980 Chirurgia 88:. 507, e Saudek et al, 1989 , N. Engl J. Med 321:.. 574). In un'altra forma di realizzazione, vengono utilizzati materiali polimerici (vedi applicazioni mediche della Controlled Release, Langer e Wise (a cura di), CRC Pres, Boca Raton, Florida (1974);... Controlled Drug biodisponibilità, Drug Product Design e prestazioni, Smolen e sfera . Rev. Macromol Chem Ranger e Peppas, J. Macromol Sci 23:61 (1983);; (eds.), Wiley, New York (1984) vedi anche Levy et al, 1985, Science 228:.... 190; Durante et al, 1989, Ann Neurol 25:.... 351; Howard et al, 1989 J. Neurosurg 71: 105).. In un'altra forma di realizzazione, un sistema di rilascio controllato è posto in prossimità della porta della composizione, cioè, il polmone, quindi, richiede solo una frazione della dose sistemica (vedi, ad esempio, Goodson, nelle applicazioni mediche di Controlled Release, supra, vol . 2, pp. 115-138 (1984)).

Altri sistemi a rilascio controllato sono discussi nella revisione da Langer (Science 249: 1527-1533 (1990)), i cui contenuti sono qui incorporati per riferimento.

Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione comprendono indicativamente una quantità terapeuticamente efficace di un vivo attenuato, virus occidentale hEbola inattivato o ucciso, o virus ricombinante hEbola o chimerico, e un veicolo farmaceuticamente accettabile. In una forma specifica, il termine "farmaceuticamente accettabile" significano che sono approvati da una agenzia di regolamentazione del federale o di un governo statale o elencati nella Farmacopea degli Stati Uniti o di altri farmacopea generalmente riconosciuti per l'impiego negli animali, e più in particolare negli esseri umani. Il termine "vettore" si riferisce ad un diluente, adiuvante, eccipiente o veicolo con cui la composizione farmaceutica viene somministrata. Tali compagnie farmaceutiche sono illustratively liquidi sterili, come l'acqua e gli oli, compresi quelli del petrolio, animale, vegetale o di origine sintetica, come l'olio di arachidi, olio di soia, olio minerale, olio di sesamo e simili. L'acqua è un elemento portante preferito quando la composizione farmaceutica viene somministrato per via endovenosa. Soluzioni saline e soluzioni di destrosio e glicerolo acquose sono eventualmente utilizzati come vettori di liquidi, in particolare per soluzioni iniettabili. Eccipienti farmaceutici adatti includono amido, glucosio, lattosio, saccarosio, gelatina, malto, riso, farina, gesso, gel di silice, stearato di sodio, glicerolo monostearato, talco, sodio cloruro, latte scremato essiccato, glicerolo, propilene, glicole, acqua, etanolo e simili. La composizione, se lo si desidera, contiene anche bagnanti o emulsionanti, agenti o agenti tampone pH. Queste composizioni opzionalmente assumono la forma di soluzioni, sospensioni, emulsioni, compresse, pillole, capsule, polveri, formulazioni a rilascio prolungato e simili. La composizione è opzionalmente formulato come una supposta, con leganti tradizionali e vettori come trigliceridi. Formulazione orale comprende illustratively vettori standard come gradi farmaceutiche di mannitolo, lattosio, amido, magnesio stearato, saccarina sodica, cellulosa, carbonato di magnesio, ecc Esempi di vettori farmaceutiche idonee sono descritte in "Scienze Farmaceutiche della Remington" di EW Martin. La formulazione dovrebbe adattarsi alla modalità di somministrazione.

In una forma di realizzazione preferita, la composizione è formulata secondo le procedure di routine come una composizione farmaceutica adatta per la somministrazione endovenosa di esseri umani. In genere, composizioni per somministrazione endovenosa sono soluzioni tampone acquoso isotonica sterile. La composizione comprende anche un agente solubilizzante opzionale e un anestetico locale come la lidocaina per alleviare il dolore al sito di iniezione. Generalmente, gli ingredienti vengono forniti separatamente o mescolati insieme in forma di dosaggio unitario, per esempio, come polvere liofilizzata secca o concentrato privo di acqua in un recipiente ermeticamente chiuso, come una fiala o Sachette indicativa della quantità di agente attivo.Qualora la composizione deve essere somministrato per infusione, si può fare a meno di una bottiglia di infusione contenente acqua di qualità farmaceutica sterile o soluzione fisiologica.Quando la composizione viene somministrata mediante iniezione, una fiala di acqua sterile per preparazioni iniettabili o soluzione salina viene eventualmente fornito in modo che gli ingredienti possono essere miscelati prima della somministrazione.

Le composizioni farmaceutiche dell'invenzione sono indicativamente formulate come forme neutre o sale. Sali farmaceuticamente accettabili indicativamente includono quelli formati con i gruppi amminici liberi, come quelli derivati da cloridrico, fosforico, acetico, ossalico, tartarico, ecc, e quelle formate con gruppi carbossilici liberi, come quelli derivati da sodio, potassio, ammonio, calcio, idrossidi di ferro, isopropilammina, trietilammina, 2 ethylamino etanolo, istidina, procaina, ecc

La quantità della composizione farmaceutica dell'invenzione che sarà efficace nel trattamento di una particolare patologia o condizione dipenderà dalla natura del disturbo o condizione, e può essere determinato mediante tecniche cliniche standard. Inoltre, test in vitro sono eventualmente impiegati per aiutare a identificare gli intervalli ottimali di dosaggio. La dose esatta da impiegare nella formulazione dipenderà anche la via di somministrazione, e la gravità della malattia o disturbo, e dovrebbe essere deciso in base al giudizio del medico e delle circostanze di ogni paziente. Tuttavia, le dosi adatte per la somministrazione endovenosa sono in genere circa 20 a 500 microgrammi di principio attivo per chilogrammo di peso corporeo. Le dosi adatte per somministrazione intranasale genere sono di circa 0,01 pg / kg di peso corporeo a 1 mg / kg di peso corporeo. Dosi efficaci possono essere estrapolati dalle curve dose-risposta derivate da sistemi di test in vitro o su animali modello.

Supposte contengono generalmente l'ingrediente attivo nel range di 0,5% a 10% in peso;formulazioni orali contengono preferibilmente 10% a 95% di ingrediente attivo.

L'invenzione fornisce anche un pacchetto farmaceutico o kit comprendente uno o più contenitori riempiti con uno o più degli ingredienti delle composizioni farmaceutiche dell'invenzione.Facoltativamente associato a tale contenitore (s) è un avviso nella forma prescritta da un'agenzia governativa che disciplina la produzione, l'uso o la vendita di prodotti farmaceutici o biologici, quali comunicazione riflette l'approvazione dall'agenzia di fabbricazione, l'uso o la vendita per l'amministrazione umano. In una forma di realizzazione preferita, il kit contiene un agente antivirale dell'invenzione, ad esempio, un anticorpo specifico per i polipeptidi codificati da una sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10, o come mostrato in SEQ ID NOs: 2-9, 59 , o 11-19, o qualsiasi epitopo hEbola, o un polipeptide o proteina della presente invenzione, o una molecola di acido nucleico dell'invenzione, da solo o in combinazione con adiuvanti, antivirali, antibiotici, analgesici, broncodilatatori, o altri eccipienti farmaceuticamente accettabili .

La presente invenzione ulteriormente comprende kit compreso un contenitore contenente una composizione farmaceutica della presente invenzione e istruzioni per l'uso.

Rilevamento saggi

La presente invenzione fornisce un metodo per rilevare un anticorpo che si lega immunospecifically al virus hEbola, in un campione biologico, tra cui ad esempio sangue, siero, plasma, saliva, urina, feci, ecc, da un paziente affetto da un'infezione hEbola, e / o febbre emorragica. In una forma di realizzazione specifica, il metodo comprendendo contattare il campione con il virus hEbola, per esempio, di deposito adesione No. 200706291, o una sequenza genomica acido nucleico di SEQ ID NOs: 1 o 10, direttamente immobilizzato su un substrato e rilevare la virus-anticorpo legato direttamente o indirettamente da un anticorpo anti-isotipo marcato eterologa. In un'altra forma di realizzazione specifica, il campione viene contattato con una cellula ospite infetta dal virus hEbola, per esempio, di cassetta di adesione No. 200706291, o una sequenza genomica acido nucleico di SEQ ID NOs: 1 o 10, e il limite anticorpo è opzionalmente rilevato dal test di immunofluorescenza.

Un metodo esemplare per rilevare la presenza o l'assenza di un polipeptide o di acido nucleico dell'invenzione in un campione biologico comporta l'ottenimento di un campione biologico da varie fonti e contattare il campione con un composto o un agente in grado di rilevare un epitopo o acido nucleico (ad esempio , mRNA, DNA genomico) del virus hEbola tale che la presenza del virus hEbola viene rilevato nel campione. Un agente preferito per rilevare hEbola mRNA o RNA genomico del trovato è una sonda di acido nucleico marcata capace di ibridare al mRNA o RNA genomico che codifica un polipeptide dell'invenzione. La sonda di acido nucleico è, per esempio, una molecola di acido nucleico compresa la sequenza nucleotidica di SEQ ID NOs: 1 o 10, un complemento della stessa, o una sua porzione, come un oligonucleotide di almeno 15, 20, 25, 30, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 o più nucleotidi contigui di lunghezza e sufficiente per ibridano specificamente in condizioni stringenti ad un hEbola mRNA o RNA genomico.

Come usato qui, il termine "condizioni rigorose" descrive le condizioni per l'ibridazione e il lavaggio in base al quale le sequenze nucleotidiche aventi almeno il 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% di identità tra loro tipicamente rimangono ibridizzate una all'altra. Tali condizioni di ibridazione sono descritti in, per esempio, ma non limitati a, i protocolli attuali in Biologia Molecolare, John Wiley & Sons, New York (1989), 6.3.1 6.3.6;Metodi di base in Biologia Molecolare, Elsevier Science Publishing Co., Inc., NY (1986), pp 75 78 e 84 87.; e Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982), pp. 387 389, e sono ben noti agli esperti del ramo. Un preferito, ma non limitativo, delle condizioni di ibridazione stringenti è ibridazione in 6 × cloruro di sodio / citrato di sodio (SSC), 0,5% SDS a circa 68 ° C seguita da uno o più lavaggi in 2 x SSC, 0,5% SDS a camera temperatura. Un altro preferito, ma non limitativo, delle condizioni di ibridazione stringenti è ibridazione in 6 × SSC a circa 45 ° C seguita da uno o più lavaggi in 0,2 × SSC, 0,1% SDS a 50 a 65 ° C.

Una sonda di acido nucleico, polinucleotide, oligonucleotidi, o altro acido nucleico è preferibilmente purificato. Una sequenza nucleotidica o "isolata" "purificato" è sostanzialmente privo di materiale cellulare o di altre proteine contaminanti dalla fonte di cellule o tessuti da cui il nucleotide è derivato, o è sostanzialmente esente da precursori chimici o altri prodotti chimici quando sintetizzata chimicamente. Il linguaggio "sostanzialmente privo di materiale cellulare" comprende preparazioni dei nucleotidi / oligonucleotide in cui il nucleotide / oligonucleotide viene separato dai componenti cellulari delle cellule da cui è isolato o prodotti. Così, un nucleotide / oligonucleotide che è sostanzialmente privo di materiale cellulare comprende le preparazioni del nucleotide con meno di circa il 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5% o 1% (in peso secco) di materiale contaminante. Quando nucleotide / oligonucleotide viene prodotto per sintesi chimica, è preferibilmente sostanzialmente priva di precursori chimici o altre sostanze chimiche, cioè, è separato da precursori chimici o altre sostanze chimiche che sono coinvolti nella sintesi della proteina. Di conseguenza, tali preparati del nucleotide / oligonucleotide hanno meno di circa il 30%, 20%, 10%, o 5% (in peso secco) di precursori chimici o composti diversi dal nucleotide / oligonucleotide di interesse. In una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, il nucleotide / oligonucleotide è isolato o purificato.

In un'altra forma di realizzazione preferita specifica, la presenza del virus hEbola viene rilevato nel campione da una reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa (RT-PCR) utilizzando i primer che sono costruiti sulla base di una sequenza nucleotidica parziale del genoma del virus hEbola, per esempio, quella di deposito adesione No. 200706291, o che hanno una sequenza genomica di acido nucleico di SEQ ID Nn 1 o 10 In una forma di realizzazione non limitativo specifico, primer preferito da utilizzare in un metodo RT-PCR sono i primer sono descritte in dettaglio nel presente documento.

Nella forma di realizzazione specifica più preferita, la presente invenzione fornisce un real-time PCR quantitativa per rilevare la presenza di virus hEbola in un campione biologico sottoponendo il cDNA ottenuto mediante trascrizione inversa di RNA totale estratto dal campione di reazioni PCR utilizzando la specifica primer descritti in dettaglio in questa sede, e un colorante fluorescente, come SYBR® Green I, che diventa fluorescente quando si lega aspecifico di DNA a doppia elica. I segnali di fluorescenza di queste reazioni vengono acquisite al termine delle fasi di estensione come prodotto di PCR è generato su una gamma di cicli termici, consentendo la determinazione quantitativa della carica virale nel campione sulla base di un plot di amplificazione.

Un agente preferito per rilevare hEbola è un anticorpo che si lega specificamente un polipeptide dell'invenzione o qualsiasi epitopo hEbola, preferibilmente un anticorpo con un'etichetta rilevabile.Gli anticorpi sono indicativamente policlonali, o più preferibilmente, monoclonale. Un anticorpo intatto, o un suo frammento (ad esempio, Fab o F (ab ') 2 ) è presente operabile.

Il termine "etichetta", con riferimento alla sonda o anticorpo, destinato a comprendere all'etichettatura diretta della sonda o anticorpo accoppiando (cioè, fisicamente collega) una sostanza rilevabile alla sonda o anticorpo, opzionalmente tramite un linker, nonché etichettatura indiretta della sonda o di anticorpi da parte reattività con un altro reagente che viene etichettato direttamente. Esempi di etichettatura indiretta comprendono il rilevamento di un anticorpo primario utilizzando un anticorpo secondario fluorescente e fine etichettatura di una sonda di DNA con biotina tale che è rilevabile con streptavidina fluorescente. Il metodo di rilevazione dell'invenzione è opzionalmente utilizzato per rilevare mRNA, proteine (o qualsiasi epitopo), o RNA genomico in un campione in vitro e in vivo. Esemplare in tecniche in vitro per la rilevazione di mRNA includono ibridazioni settentrionali, ibridazioni in situ, RT-PCR, e la protezione RNase.Nelle tecniche in vitro per la rilevazione di un epitopo di hEbola illustratively includere saggi enzimatici immunoenzimatico (ELISA), western blot, immunoprecipitazione e immunofluorescenza. Nelle tecniche in vitro per la rilevazione di RNA genomico includere ibridazioni settentrionali, RT-PCT, e la protezione RNase. Inoltre, le tecniche in vivo per il rilevamento di hEbola includono l'introduzione in un organismo soggetto un anticorpo marcato diretto contro il polipeptide. In una forma di realizzazione, l'anticorpo è marcato con un marcatore radioattivo la cui presenza e la posizione nell'organismo soggetto viene rilevata da tecniche di imaging standard, tra cui autoradiografia.

In una forma di realizzazione specifica, i metodi implicano inoltre l'ottenimento di un campione di controllo da un soggetto controllo, contattando il campione di controllo con un composto o agente capace di rilevare hEbola, ad esempio, un polipeptide dell'invenzione o mRNA o RNA genomico che codifica un polipeptide dell'invenzione , tale che la presenza di hEbola o il polipeptide o mRNA o RNA genomico che codifica per il polipeptide viene rilevata nel campione, e confrontando l'assenza di hEbola o il polipeptide o mRNA o RNA genomico che codifica il polipeptide nel campione di controllo con la presenza di hEbola , o il polipeptide o mRNA o DNA genomico che codifica il polipeptide nel campione di prova.

L'invenzione comprende anche kit per rilevare la presenza di hEbola o un polipeptide o acido nucleico dell'invenzione in un campione di prova. Il kit comprende indicativamente un composto marcato o agente capace di rilevare hEbola o il polipeptide o una molecola di acido nucleico che codifica per il polipeptide in un campione di prova e, in certe forme di realizzazione, un metodo per determinare l'ammontare del polipeptide o mRNA nel campione (ad esempio , un anticorpo che lega il polipeptide o un oligonucleotide sonda che si lega al DNA o mRNA codificante il polipeptide). I kit opzionale includono istruzioni per l'uso.

Per i kit a base di anticorpi, il kit comprende indicativamente: (1) un primo anticorpo (ad esempio, attaccato ad un supporto solido), che si lega ad un polipeptide dell'invenzione o hEbola epitopo;e, opzionalmente, (2) un secondo anticorpo differente che si lega sia al polipeptide o il primo anticorpo ed è preferibilmente coniugato ad un agente rilevabile.

Per kit basato oligonucleotide-, il kit comprende indicativamente: (1) un oligonucleotide, ad esempio, un oligonucleotide marcato in modo rilevabile, che si ibrida ad una sequenza di acido nucleico che codifica un polipeptide dell'invenzione o di una sequenza nel genoma hEbola; o (2) una coppia di primers utili per amplificare una molecola di acido nucleico contenente una sequenza hEbola. Il kit include opzionalmente un agente tampone, un conservante, o un agente di proteina stabilizzante. Il kit comprende opzionalmente componenti necessari per rilevare l'agente rilevabile (ad esempio, un enzima o un substrato). Il kit contiene opzionalmente un campione di controllo o di una serie di campioni di controllo che possono essere analizzati e confrontati con il campione conteneva. Ogni componente del kit è solitamente racchiuso all'interno di un singolo contenitore e tutti i vari contenitori sono all'interno di un unico pacchetto insieme alle istruzioni per l'uso.

Test di screening per identificare agenti antivirali

L'invenzione fornisce metodi per l'identificazione di un composto che inibisce la capacità del virus di infettare hEbola un host o una cellula ospite. In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce metodi per l'identificazione di un composto che riduce la capacità del virus hEbola di replicare in un host o una cellula ospite. Qualsiasi tecnica ben nota per il bravo artigiano è illustratively utilizzato per schermo per un composto utile per abolire o ridurre la capacità del virus di infettare hEbola un host e / o per replicare in un host o di una cellula ospite.

In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce metodi per l'identificazione di un composto che inibisce la capacità del virus hEbola di replicare in un mammifero o di una cellula di mammifero. Più specificamente, l'invenzione fornisce metodi per l'identificazione di un composto che inibisce la capacità del virus di infettare hEbola un mammifero o una cellula di mammifero. In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce metodi per l'identificazione di un composto che inibisce la capacità del virus hEbola riprodurre in una cellula di mammifero. In una forma di realizzazione specifica, la cellula di mammifero è una cellula umana.

In un'altra forma di realizzazione, una cella viene contattato con un composto di prova e infettato con il virus hEbola. In alcune forme di realizzazione, una coltura di controllo infettato con il virus hEbola in assenza di un composto in esame. La cella è opzionalmente contattato con un composto di prova prima, in concomitanza con, o successivamente alla infezione con il virus hEbola. In una forma di realizzazione specifica, la cellula è una cellula di mammifero. In una forma di realizzazione ancora più specifico, la cellula è una cellula umana. In alcune forme di realizzazione, la cella viene incubato con il composto di prova per almeno 1 minuto, almeno 5 minuti, almeno 15 minuti, almeno 30 minuti, almeno 1 ora, almeno 2 ore, per almeno 5 ore, almeno 12 ore, o almeno 1 giorno. Il titolo del virus è opzionalmente misurata in qualsiasi momento durante il dosaggio. In alcune forme di realizzazione, un decorso di crescita virale in coltura è determinata. Se la crescita virale viene inibita o ridotta in presenza del composto di prova, il composto di prova viene identificato come essere efficace nell'inibire o ridurre la crescita o l'infezione del virus hEbola. In una forma di realizzazione specifica, il composto che inibisce o riduce la crescita del virus hEbola è testato per la sua capacità di inibire o ridurre il tasso di crescita di altri virus per testare la sua specificità per il virus hEbola.

In una forma di realizzazione, un composto in esame viene somministrata ad un modello animale e il modello animale è stato infettato con il virus hEbola. In alcune forme di realizzazione, un modello di controllo animale è stato infettato con il virus hEbola senza la somministrazione di un composto in esame. La sostanza in esame viene somministrata prima opzione, in concomitanza con, o successivamente alla infezione con il virus hEbola. In una forma di realizzazione specifica, il modello animale è un mammifero. In una realizzazione ancora più specifico, il modello animale è, ma non è limitato a, un ratto di cotone, un topo, o una scimmia. Il titolo del virus nel modello animale è opzionalmente misurata in qualsiasi momento durante il dosaggio. In alcune forme di realizzazione, un decorso di crescita virale in coltura è determinata. Se la crescita virale viene inibita o ridotta in presenza del composto di prova, il composto di prova viene identificato come essere efficace nell'inibire o ridurre la crescita o l'infezione del virus hEbola. In una forma di realizzazione specifica, il composto che inibisce o riduce la crescita del hEbola nel modello animale è testato per la sua capacità di inibire o ridurre il tasso di crescita di altri virus per testare la sua specificità per il virus hEbola.

Secondo il metodo dell'invenzione, un essere umano o un animale viene opzionalmente trattati per per EboBun o EboIC, altra infezione virale o infezione batterica somministrando una quantità efficace di una composizione terapeutica inventivo. Preferibilmente, un vaccino viene somministrato come profilassi. Un "valore effettivo" è un importo che sarà indurre una risposta immunitaria in un soggetto. Indicativamente, una quantità efficace delle composizioni di questa invenzione varia da ng / kg di milligrammi / kg importi per i bambini e adulti. Dosaggi equivalenti per pesi corporei più leggeri o più pesanti possono essere facilmente determinato. La dose deve essere adattata alla persona a cui la composizione è amministrato e varia con l'età, il peso e il metabolismo dell'individuo. L'importo esatto della composizione necessaria varia da soggetto a soggetto, a seconda della specie, età, peso e condizioni generali del soggetto, la particolare peptide o polipeptide usati, la sua modalità di somministrazione e simili. Una quantità appropriata può essere determinata da uno di abilità ordinaria nell'arte utilizzando solo la sperimentazione di routine dato gli insegnamenti qui. Un esperto del ramo si renderà conto che i dosaggi sono meglio ottimizzati dal medico praticante o veterinario e metodi per la determinazione delle dotazioni dosi e regimi e preparare forme di dosaggio sono descritti, per esempio, in Scienze Farmaceutiche di Remington, (Martin, EW, ed, ultima. edizione), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania. Preferibilmente, una singola somministrazione è atto ad indurre una risposta immunitaria.

I metodi che coinvolgono tecniche biologiche convenzionali sono qui descritti. Tali tecniche sono generalmente noti nella tecnica e sono descritti in dettaglio nella metodologia trattati come Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, vol.. 1-3, ed. Sambrook et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.; e protocolli attuali in Biologia Molecolare, ed. Ausubel et al., Greene Editoria e Wiley-Interscience, New York, 1992 (con aggiornamenti periodici). Metodi immunologici (ad esempio, la preparazione di anticorpi antigene-specifici, immunoprecipitazione e immunoblotting) sono descritti, ad esempio, nei protocolli attuali in Immunologia, ed. Coligan et al, John Wiley & Sons, New York, 1991.; e metodi di analisi immunologica, ed. Masseyeff et al., John Wiley & Sons, New York, 1992.

Forme di realizzazione composizioni e metodi inventivi sono illustrati nei seguenti esempi dettagliati. Questi esempi sono forniti per scopi illustrativi e non sono considerati i limiti sulla portata delle composizioni e metodi inventivi.

ESEMPI Esempio 1 appena scoperto Virus Ebola Associata con febbre emorragica Focolaio in Bundibugyo, Uganda

Alla fine di novembre sono stati segnalati 2007 casi di scompenso cardiaco nei comuni di Bundibugyo e Kikyo in Bundibugyo District, Western Uganda (FIG. 1A). Questi campioni sono stati analizzati come descritto da Towner, JS, et al. PLoS Pathog, 2008 Novembre; 4 (11): e1000212, i cui contenuti sono qui incorporati per riferimento per i metodi, i risultati, i reagenti, e tutti gli altri aspetti della pubblicazione. Un totale di 29 campioni di sangue inizialmente sono stati raccolti da casi sospetti e ha mostrato evidenza di infezione acuta ebolavirus in otto esemplari con un ampio reattiva all'antigene ebolavirus cattura saggio conosciuto per reattività crociata con le diverse specie Ebolavirus 'e un saggio di cattura delle IgM sulla base Zaire ebolavirus reagenti (Tabella 1). Questi campioni sono risultati negativi quando inizialmente analizzati con alta sensibilità real-time RT-PCR test specifici per tutti i noti Zaire e Sudan ebolaviruses e marburgviruses. Tuttavia, un'ulteriore prova di infezione ebolavirus acuta è stata ottenuta utilizzando un tradizionalmente meno (saggi di RT-PCR rispetto al tempo reale) sensibili, ma più in generale reattiva filovirus L-specific gene RT-PCR (1 campione) (Tabella 1). Le analisi della sequenza del frammento di PCR (400 bp del gene virus L) ha rivelato il motivo del fallimento iniziale del real-time RT-PCR test, come la sequenza era diversa da quella dei 4 specie conosciute di ebolavirus, anche se distante relativi in Costa d'Avorio ebolavirus. In totale, 9 dei 29 campioni hanno mostrato evidenza di infezione ebolavirus, e tutti i test sono risultati negativi per Marburgvirus (dati non riportati).

Circa il 70% del genoma del virus è stato rapidamente sequenziato da RNA totale estratto da un siero del paziente (# 200706291) utilizzando una nuova costituzione metodo metagenomics pyrosequencing (454 Life Sciences), che coinvolge cicli successivi di amplificazione del DNA casuale 8 . Utilizzando il progetto di sequenza appena derivata, un real-time RT-PCR specifica per il gene NP di questo virus è stato rapidamente sviluppato e valutato. Il dosaggio è stato dimostrato di avere un'ottima sensibilità (Tabella 1), trovando positivi tutti i primi sei campioni che sono risultati positivi da una cattura dell'antigene del virus (cinque esemplari) o test di isolamento del virus (quattro esemplari). La cattura dell'antigene, IgM, IgG e di nuova concezione PCR real-time sono stati rapidamente trasferiti al virus Uganda Istituto di ricerca nel corso del focolaio per facilitare la rapida identificazione e l'isolamento dei casi di Ebola nella zona interessata per un controllo efficace del focolaio . L'epidemia ha continuato fino alla fine di dicembre 2007 e ha provocato 149 casi sospetti e 37 decessi 9 .

Tabella 1 Ebolavirus risultati diagnostici di primi 29 campioni ottenuti da Bundibugyo District con i numeri dei campioni numerici assegnati. RT-PCR si riferisce ai risultati ottenuti dalla PCR convenzionale utilizzando i ampiamente reattivi / B primer Filo A 13 . Ag, IgM e IgG si riferiscono ai risultati di test basati su ELISA 10, 11 con reagenti Ebolavirus Zaire mentre l'isolamento del virus si riferisce ai tentativi di coltura su cellule Vero E6 ' 2 . Q-RT-PCR si riferisce ai risultati ottenuti con il ottimizzata ebolavirus Bundibugyo specifiche real-time RT-PCR con i valori di soglia ciclo (Ct) di positivi (Pos) campioni indicati nella colonna a destra. * # 200706291 campione è il campione clinico da cui prototipo isolare # 811250 è stato ottenuto.

TABELLA 1

Campione	RT				Virus	Q-RT
No.	PCR	Ag	IgM	IgG	Isolamento	PCR	Ct


200706288	neg	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706289	neg	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706290	neg	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706291 *	Pos	Pos	neg	neg	Pos	Pos	23.64
200706292	neg	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706293	neg	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706294	neg	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706295	neg	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706296	neg	neg	Pos	Pos	neg	neg	40
200706297	neg	neg	Pos	Pos	neg	neg	40
200706298	neg	Pos	Pos	Pos	neg	Pos	34.83
200706299	neg	neg	Pos	Pos	neg	neg	40
200706300	neg	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706301	neg	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706302	neg	Pos	Pos	neg	neg	Pos	35.01
200706303	neg	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706304	neg	neg	neg	neg	Pos	Pos	38.18
200706305	neg	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706306	neg	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706307	neg	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706320	ND	Pos	neg	neg	Pos	Pos	30.24
200706321	ND	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706322	ND	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706323	ND	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706324	ND	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706325	ND	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706326	ND	neg	neg	neg	neg	neg	40
200706327	ND	Pos	neg	neg	Pos	Pos	34.41
200706328	ND	neg	neg	neg	neg	neg	40

L'intera sequenza del genoma di questo virus è stato completato con un approccio di sequenziamento di primer walking classico su RNA. Il genoma completo del ebolavirus Eb non era disponibile, così anche è stato derivato da una simile combinazione di casuale pyrosequencing innescato e approcci di primer walking. Acquisizione di queste sequenze consentito per la prima volta l'analisi filogenetica dei genomi completi di rappresentanti di tutte le specie conosciute di virus Ebola e Marburg. L'analisi ha rivelato che il virus di recente scoperta differiva da quattro specie Ebolavirus esistenti (FIG. 1), con circa il 32% dalla differenza nucleotide anche il parente più prossimo, EboIC (Tabella 2). Simile divergenza genoma completo (35-45%) si vede tra le specie Ebolavirus precedentemente caratterizzati.

Tabella 2 Matrice Identità basato sui raffronti dei full-length sequenze genomiche di Zaire ebolaviruses 1976 (GenBank accession number NC - 002.549) e il 1995 (GenBank accession number AY354458), Sudan ebolavirus 2000 (GenBank accession number NC - 006.432), Costa d ' Avorio ebolavirus 1994 (SEQ ID NO: 10), Reston ebolavirus 1989 (GenBank accession number NC - 004.161), e Bundibugyo ebolavirus 2007 (SEQ ID NO: 1).

	TABELLA 2

	Zaire	Sudan	EboIC	EboBun	Reston
	'95	'00	'94	'07	'89


Zaire '76	0,988	0,577	0,630	0,632	0,581
Zaire '95		0,577	0,631	0,633	0,581
Sudan '00			0,577	0,577	0,609
EboIC '94				0,683	0,575
EboBun '07				0,576

Il materiale e le informazioni ottenute dalla scoperta del nuovo virus EboBun unico e la realizzazione che insieme a EboIC questi virus rappresentano una radura di Bundibungyo-Costa d'Avorio Ebola specie di virus è prezioso, e rende possibile lo sviluppo di strumenti clinici, diagnostici e di ricerca diretta alle infezioni hEbola umana.

Materiali e metodi

Ebolavirus Rilevamento e isolamento del virus.

Diverse tecniche diagnostiche sono stati usati per ciascun campione: (i) di cattura dell'antigene, saggi IgG, IgM e sono state eseguite come descritto in precedenza 11, (ii) isolamento del virus tentativi sono stati eseguiti su cellule Vero E6 ' 2 e monitorato per 14 giorni; (Iii) l'RNA è stato estratto e testato per Zaire il 16 e il Sudan ebolavirus e Marburgvirus 4 con real-time quantitativa saggi di RT-PCR progettati per rilevare tutte le specie conosciute di ogni rispettive specie di virus del primer / sonda per l'analisi Sudan ebolavirus erano EboSudBMG 1 ( +) 5'-GCC ATG GIT TCA GGT TTG AG-3 '(SEQ ID NO: 21), EboSudBMG 1 (-) 5'-GGT IAC ATT GGG CAA CAA TTC A-3' (SEQ ID NO: 22) e Ebola Sudan BMG Probe 5'FAM-AC GGT GCA CAT TCT CCT TTT CTC GGA-BHQ1 (SEQ ID NO: 23)]; (Iv) la RT-PCR è stata effettuata con il filo A / B set di primer come descritto in precedenza 16 usando Superscript III (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. Il campione 200706291 stato scelto come campione di riferimento per ulteriori analisi di sequenza.

Genome Sequencing.

Pyrosequencing è stata effettuata utilizzando l'approccio sviluppato da 454 Life Sciences, e il metodo descritto da Cox-Foster et al. 8 Successivamente virus intero genoma di primer walking è stata eseguita come descritto in precedenza 17 , ma utilizzando i primer specifici per Bundibugyo ebolavirus RT-PCR di amplificazione. In totale, l'intero genoma del virus è stato amplificato in sei frammenti sovrapposti RT-PCR (tutti i primer elencate 5 'a 3'): il frammento A (prevista formato 2,7 kb) è stato amplificato utilizzando forward-GTGAGACAAAGAATCATTCCTG (SEQ ID NO: 24) con retromarcia -CATCAATTGCTCAGAGATCCACC (SEQ ID NO: 25); frammento B (formato previsto 3.0 kb) è stato amplificato utilizzando forward-CCAACAACACTGCATGTAAGT (SEQ ID NO: 26) con inversione-AGGTCGCGTTAATCTTCATC (SEQ ID NO: 27); frammento C (formato previsto 3,5 kb) è stato amplificato utilizzando forward-GATGGTTGAGTTACTTTCCGG (SEQ ID NO: 28) con inversione-GTCTTGAGTCATCAATGCCC (SEQ ID NO: 29); frammento D (formato previsto 3.1 kb) è stato amplificato utilizzando forward-CCACCAGCACCAAAGGAC (SEQ ID NO: 30) con inversione-CTATCGGCAATGTAACTATTGG (SEQ ID NO: 31); frammento E (formato previsto 3,4 kb) è stato amplificato utilizzando forward-GCCGTTGTAGAGGACACAC (SEQ ID NO: 32) con inversione-CACATTAAATTGTTCTAACATGCAAG (SEQ ID NO: 33) e il frammento F (prevista formato 3,5 kb) è stato amplificato utilizzando forward-CCTAGGTTATTTAGAAGGGACTA (ID SEQ NO: 34) con inversione-GGT AGA TGT ATT GAC AGC AAT ATC (SEQ ID NO: 35).

L'esatto 5 'e 3' estremità di Bundibugyo ebolavirus sono stati determinati da 3 'RACE da virus RNA estratto da virus infetti monostrati di cellule Vero E6 usando il reagente di isolamento Tripure. RNA sono stati poi poliadenilato in vitro utilizzando A-Plus poli (A) polimerasi kit tailing (Biotecnologie Epicenter) seguendo le istruzioni del produttore e quindi purificati utilizzando un kit RNeasy (Qiagen) seguendo protocolli standard. Dieci microlitri di in vitro poliadenilato RNA sono stati aggiunti come modello in reazioni di RT-PCR, usando SuperScript III One-Step sistema RT-PCR con Taq Platinum High Fidelity (Invitrogen) seguendo il protocollo del produttore. Due reazioni di RT-PCR in parallelo utilizzando l'oligo (dT) -contenenti 3'RACE-AP Primer (Invitrogen) mescolato con 1 di 2 primer specifici virali, Ebo-U 692 (-) ACAAAAAGCTATCTGCACTAT (SEQ ID NO: 36) e Ebo- V18269 (+) CTCAGAAGCAAAATTAATGG (SEQ ID NO: 37), ha generato ~700 nt lunghi frammenti contenenti estremità 3 'di entrambi i RNA genomici e antigenomic. I risultanti prodotti di RT-PCR sono stati analizzati mediante elettroforesi su agarosio e bande di DNA delle dimensioni corrette sono stati purificati utilizzando QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) e sequenziati utilizzando protocolli standard (ABI).

La sequenza nucleotidica del ebolavirus Costa d'Avorio (EboIC) isolare RNA è stato inizialmente determinato utilizzando la stessa esatta strategia pyrosequencing di quello usato per Bundibugyo ebolavirus descritto sopra. Questo metodo ha generato sequenza per circa il 70% dell'intero genoma. Questo progetto sequenza è stata poi usata per progettare una strategia a piedi genoma Primer intero per riempire eventuali lacune e confermando la sequenza iniziale. I seguenti primers specifici per Ebolavirus Costa d'Avorio sono stati usati per generare frammenti di RT-PCR, designato AF, come segue: Frammento A (prevista formato 3.0 kb) è stato amplificato utilizzando forward-GTGTGCGAATAACTATGAGGAAG (SEQ ID NO: 38) e inversa-GTCTGTGCAATGTTGATGAAGG (SEQ ID NO: 39); Frammento B (formato previsto 3.2 kb) è stato amplificato utilizzando forward-CATGAAAACCACACTCAACAAC (SEQ ID NO: 40) e reverse-GTTGCCTTAATCTTCATCAAGTTC (SEQ ID NO: 41); Frammento C (prevista formato 3.0 kb) è stato amplificato utilizzando forward-GGCTATAATGAATTTCCTCCAG (SEQ ID NO: 42) e reverse-CAAGTGTATTTGTGGTCCTAGC (SEQ ID NO: 43); frammento D (formato previsto 3,5 kb) è stato amplificato utilizzando forward-GCTGGAATAGGAATCACAGG (SEQ ID NO: 44) e reverse-CGGTAGTCTACAGTTCTTTAG (SEQ ID NO: 45); frammento E (formato previsto 4,0 kb) è stato amplificato utilizzando forward-GACAAAGAGATTAGATTAGCTATAG (SEQ ID NO: 46) e reverse-GTAATGAGAAGGTGTCATTTGG (SEQ ID NO: 47); frammento F (prevista formato 2,9 kb) è stato amplificato utilizzando forward-CACGACTTAGTTGGACAATTGG (SEQ ID NO: 48) e reverse-CAGACACTAATTAGATCTGGAAG (SEQ ID NO: 49); frammento G (prevista formato 1.3 kb) è stato amplificato utilizzando forward-CGGACACACAAAAAGAAWRAA (SEQ ID NO: 50) e reverse-CGTTCTTGACCTTAGCAGTTC (SEQ ID NO: 51); e frammento H (prevista formato 2.5 kb) è stato amplificato utilizzando forward-GCACTATAAGCTCGATGAAGTC (SEQ ID NO: 52) e reverse-TGGACACACAAAAARGARAA (SEQ ID NO: 53). Una lacuna nella contig sequenza era situato tra i frammenti C e D e questo è stato risolto utilizzando i seguenti primer per generare un frammento previsto di 1,5 kb: forward-CTGAGAGGATCCAGAAGAAAG (SEQ ID NO: 54) e reverse-GTGTAAGCGTTGATATACCTCC (SEQ ID NO: 55 ). I terminali ~ 20 nucleotidi della sequenza non sono state determinate sperimentalmente, ma sono stati desunti dal confronto con gli altri noti sequenze del genoma di Ebola.

Bundibugyo Ebolavirus Real-Time RT-PCR Assay.

I primer e le sonde impiegate nella Bundibugyo ebolavirus specifico dosaggio Q-RT-PCR sono stati i seguenti: EboU965 (+): 5'-GAGAAAAGGCCTGTCTGGAGAA-3 '(SEQ ID NO: 56), EboU1039 (-): 5'-TCGGGTATTGAATCAGACCTTGTT- 3 '(SEQ ID NO: 57) e EboU989 PRB: 5'Fam-TTCAACGACAAATCCAAGTGCACGCA-3'BHQ1 (SEQ ID NO 58). Reazioni di Q-RT-PCR sono state costituite utilizzando Apice III One-Step Q-RT-PCR (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore e correre per 40 cicli con una temperatura di 58 ° C. ricottura.

Analisi filogenetica.

Modeltest 3.7 18 è stato utilizzato per esaminare 56 modelli di sostituzione nucleotidica per determinare il modello più appropriato per i dati. Il modello reversibile Tempo generali incorporando siti invarianti e una distribuzione gamma (GTR + I + G) è stato scelto con il criterio di informazione di Akaike (AIC). Frequenze nucleotidiche erano A = 0,3278, C = 0,2101, G = 0,1832, T = 0,2789, la percentuale di siti invarianti = 0,1412, e il parametro di forma gamma = 1,0593. Un'analisi di massima verosimiglianza è stata successivamente eseguita in PAUP * 4.0b10 19 con il GTR + I + G parametri del modello. Valori di supporto bootstrap sono stati utilizzati per valutare il sostegno topologica e sono stati calcolati sulla base di 1000 pseudoreplicates 20 .

Inoltre, un bayesiano analisi filogenetica è stata condotta in MrBayes 3.2 21 utilizzando la GTR + I + G modello di sostituzione nucleotidica. Due analisi simultanee, ciascuna con quattro catene di Markov, sono stati eseguiti per 5.000.000 generazioni di campionamento ogni 100 generazioni.Prima della conclusione del periodo, il modulo AWTY stato utilizzato per valutare Markov Chain Monte Carlo convergenza per assicurare che la lunghezza dell'analisi era sufficiente 22 . Alberi generati prima della stabilizzazione dei punteggi di probabilità sono stati scartati (burn in = 40), e gli alberi rimanenti sono stati utilizzati per costruire un albero di consenso. Supporto nodale è stata valutata da valori probabilità a posteriori (> 95 = supporto statistico).

Esempio 2 immunizzazione contro EboBun

Per determinare la capacità di immunogeni a elict una risposta immunitaria nei primati non umani (NHP), macachi 12 cynomolgus, di cui 10 sono immunizzati con VSVΔG / EboBunGP oralmente (OR, n = 4), intranasale (IN, n = 4 ) o intramuscolare (IM; n = 2), in accordo con tutto il controllo degli animali e linee guida di sicurezza ed essenzialmente come descritto da Qiu, X, et al, PLoS ONE.. 2009; 4 (5): e5547. I restanti 2 animali di controllo sono vaccinati per via intramuscolare con VSVΔG / MARVGP. VSVΔG / MARVGP non fornisce protezione eterologa contro EboBun, quindi questi primati non umani soccombere alle infezioni EboBun. Gli animali sono acclimatati per 14 giorni prima infezione. Gli animali sono alimentati e monitorati due volte al giorno (pre-e post-infezione) e alimentato Chow scimmia commerciale, ghiottonerie e frutta. Allevamento arricchimento è costituito da giocattoli commerciali e stimolazione visiva.

I vaccini ricombinanti VSVΔG / EboBun vengono sintetizzati esprimono la glicoproteina EboBun (GP) (SEQ ID NO: 9), glicoproteina solubile (PSC) (SEQ ID NO: 4), o nucleoproteine (NP) (SEQ ID NO: 3). Vaccini Controllo VSVΔG / MARVGP rappresentano le proteine analoghe dal Lago Vittoria Marburgvirus (MARV) (ceppo Musoke). I seguenti risultati per GP sono simili per PSC e NP. I vaccini vengono generati utilizzando VSV (Indiana sierotipo) come descritto in precedenza.Garbutt, M, et al, J Virol., 2004; 78 (10): 5458-5465; Schnell, MJ, et al, PNAS USA, 1996.; 93 (21): 11.359-11.365. EboBun virus sfida è diversi passaggi in cellule Vero E6 prima di sfidare, come descritto in precedenza Jones, SM, et al. Nat Med, 2005; 11 (7): 786-790; Jahrling, PB, et al. J Infect Dis, 1999; 179 (Suppl 1): S224-34. Una piscina peptide immunogeno EboBun composto da 15mers con sovrapposizioni di 11 aminoacidi (Sigma-Genosys) che coprono l'intera sequenza degli immunogeni EboBun e ceppo Mayinga 1976 GP vengono utilizzati.

Dodici Filovirus naïve scimmie cynomolgus randomizzati in quattro gruppi ricevono 2 ml di 1 × 107 PFU / ml di vaccino in mezzo modificato Eagle Dulbecco (DMEM). Animali nei tre gruppi sperimentali sono vaccinati sia con: 1) 2 ml per via orale (OR) (n = 4); 2) 1 ml gocciolato in ciascuna narice, intranasale (IN) (n = 4); o 3) 1 ml ciascuna in due siti per via intramuscolare (IM) (n = 2). I due comandi sono iniettati per via intramuscolare con 2 ml di 1 × 10 7 PFU / ml di VSVΔG / MARVGP. Tutti gli animali sono sfidati per via intramuscolare 28 giorni dopo con 1.000 PFU di EboBun.

Esame di routine si svolge su post-vaccinazione 0, 2, 4, 6, 10, 14 e 21 giorni, poi 0, 3, 6, 10, 14, 19, 26 giorni, 6 e 9 mesi dopo la sfida EboBun. Per gli esami animali sono anestetizzati mediante iniezione intramuscolare con 10 mg / kg di ketaset (Ayerst). Gli esami comprendono analisi ematologiche, il monitoraggio della temperatura (rettale), frequenza respiratoria, i linfonodi, il peso, l'idratazione, gli scarichi e le mucose. Inoltre, tamponi (gola, orale, nasale, rettale, vaginale) e campioni di sangue sono raccolti (4 ml dalla vena femorale, 1 ml in provetta vacutainer EDTA, 3 ml di siero separatore tubo vacutainer). PBMC Macaco di Giava sono isolate utilizzando BD CPT citrato di sodio vacutainer (Becton Dickinson) secondo il protocollo del produttore.

Tutti VSVΔG / EboBunGP immunizzati animali sono protetti dalla sfida ad alte dosi. Questi animali non mostrano alcuna evidenza di malattia clinica dopo la vaccinazione o EboBun sfida.Entrambi gli animali di controllo dimostrino sintomi tipici associati con EboBun HF tra cui febbre, eruzioni cutanee maculari, letargia, e assenza di reazione. Continua infezione richiede euthanization. Ematologia analizza ad ogni data di esame dimostrano aumenti di piastrine-crit in sala operatoria e in gruppi di post-sfida, tuttavia, cambiamenti significativi si osservano in ogni post-vaccinazione primati non umani o nel VSVΔG / EboBunGP immunizzati post-sfida primati non umani.

EboBun produzione di anticorpi da risposta anticorpale umorale alla vaccinazione e la sfida viene esaminato da un virus come particella (VLP) test ELISA basato. Generazione di EboBun VLP viene eseguita dal protocollo per ZEBOV come descritto da Wahl-Jensen, V., et al. J Virol, 2005;79 (4): 2413-2419. ELISA viene eseguita dal protocollo descritto da Qiu, X, et al., PLoS ONE.2009; 4 (5): e5547.

I VSVΔG / MARVGP immunizzati animali non sviluppano una risposta anticorpale rilevabile a EboBun. Al contrario, le risposte anticorpali potenti vengono rilevati in tutte le / EboBunGP immunizzati animali VSVΔG indipendenti di percorso immunizzazione. Tra 14 e 21 giorni dopo la vaccinazione, tutti VSVΔG / EboBunGP immunizzato NHPs sviluppare alti livelli di IgA, IgM e IgG contro EboBunGP. Dopo sfida i titoli IgM non superino i livelli post-vaccinazione, tuttavia, IgG e IgA titoli anticorpali sono aumentati picco 14 giorni dopo-sfida poi lentamente diminuendo prima il mantenimento di un alto titolo di anticorpi relativamente fino a 9 mesi.

Il livello di anticorpi di neutralizzazione viene rilevato da un EboBun-GFP citometria a flusso neutralizzazione dosaggio nel siero raccolti nei giorni 0 e 21 post-vaccinazione. I campioni sono analizzati in duplicato per la loro capacità di neutralizzare un'infezione con EboBun-GFP in cellule VeroE6. Campioni di siero diluiti vengono incubati con un uguale volume di EboBun-GFP in DMEM, a 37 ° C, 5% di CO 2 per 1 ora seguito da aggiunta di 150 microlitri per pozzetto di una piastra da 12 pozzetti confluenti di cellule VeroE6 (MOI = 0.0005). Dopo 2 ore a 37 ° C, 5% di CO2 , 1 ml di DMEM, 2% è aggiunto fetale serym bovino (FBS), 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina per pozzetto e incubate per 5 giorni. Le cellule sono raccolte rimuovendo il supernatante della coltura, lavaggio con 1 ml di PBS, 0,04% EDTA, quindi aggiungendo 800 ml di PBS 0,04% EDTA per 5 minuti a 37 ° C prima di aggiungere 8 ml di PBS, 4% paraformaldeide (PFA) e pernottamento incubazione. Le cellule vengono acquisiti (10.000 eventi) e analizzati con CellQuest Pro v3.3 su un flusso Becton Dickinson FACSCalibur citometro.

L'OR e IN percorsi producono anticorpi neutralizzanti EboBunGP-specifici con l'OR percorso che produce il più alto con titoli post-vaccinazione. L'immunizzazione IM producono livelli rilevabili di anticorpi neutralizzanti. In confronto, 3/4 primati non umani nel gruppo OR dimostrano una riduzione del 50% nelle cellule positive EboBun-GFP ad un titolo di 1:40. Allo stesso modo, la via in risultati in una riduzione di cellule positive EboBun-GFP alla diluizione 1:40.

EboBunGP-specifiche risposte immunitarie cellulari effettrici sono determinate con IL-2 e IFN-γ saggi ELISPOT come descritto da Qin, X, et al., PLoS ONE. 2009; 4 (5): e5547 per determinare il numero di IL-2 e IFN-γ linfociti secernenti. Prima di sfidare nei giorni 10 a 14 post-vaccinazione c'è un rilevabile EboBun specifica-immunogeno risposta IFN-γ in tutti gli animali immunizzati. Il percorso IM è il più potente, inducendo circa 2 volte più IFN-γ secernenti cellule di O (p <0 10="" 26="" 2="" 4.3="" 6="" al="" alla="" animali="" aumenta="" cellule="" con="" costantemente="" del="" di="" dimostra="" e="" ebobun.="" ebobun="" font="" forte.="" forte="" forti="" giorno="" gruppo="" i="" ifn-="" il="" im="" immunizzati="" in="" indotta="" le="" n="" nbsp="" nel="" o="" or="" p="0,075)" percorsi="" percorso="" pi="" piazzandosi="" post-secondaria="" post-sfida="" producono="" rispettivamente.="" rispetto="" risposta="" risposte="" rotte.="" secernenti="" sfida="" specific="" specifica="" tre="" tutti="" una="" utti="" volte="" vsv="">

Post-vaccinazione, il gruppo chat ha anche più IL-2 cellule secernenti specifica-EboBunGP di uno dei gruppi mucosally immunizzati. Post-sfida, la via IM continua a dominare presto dopo sfida picco il giorno 10 Questa differenza mostra un trend rispetto al gruppo A (p = 0,067) ed è significativo rispetto al gruppo OR (p <0 10="" 26="" a="" al="" alto="" anticorpi="" cellule="" che="" come="" continuano="" cos="" da="" del="" di="" e="" ebobun="" effettrici.="" font="" forte.="" giorno="" gruppo="" ha="" i="" ifn-="" iga="" igg="" il-2="" il="" immunizzazione="" in="" indicando="" invece="" l="" la="" nbsp="" nello="" noltre="" o="" p="0,090)" percorsi="" percorso="" pi="" post-sfida.="" post-sfida="" post-sfidare="" potente="" potenti="" producono="" produrre="" questo="" rispetto="" risposta="" risposte="" risultati="" seguita="" sfida="" sostenuto="" specifica-ebobungp="" sviluppo="" titolo="" tre="" tutti="" una="">

Numero dei linfociti assoluti alla CD3 + , CD4 + , e CD8 + (CD3 + 4 - ) popolazioni di cellule T sono determinati mediante citometria di flusso. Nessun calo si osserva nelle popolazioni linfocitarie per uno dei VSVΔG / EboBunGP vaccinati primati non umani. Al contrario, gli animali di controllo che non sono protetti da EboBun mostrano numero dei linfociti è diminuito del 28-57%.

Numeri macrofagi sono leggermente aumentati negli animali di controllo. Tuttavia, il numero di CD14 + cellule è maggiore nel VSVΔG / EboBunGP gruppi vaccinati con il percorso IM mostra gli aumenti più significativi.

Al fine di determinare la risposta immunitaria a lungo termine dopo la sfida, EboBunGP-specifici CD4 + e CD8 + memoria linfociti T sono esaminati per la loro capacità di proliferare (CFSE - ) o di produrre IFN-γ in risposta a peptidi EboBunGP a 6 mesi post- vaccinazione. Risposte di memoria specifici EboBunGP si osservano in seguito a vaccinazione seguita da una sfida ZEBOV. Queste risposte persistono per almeno 6 mesi. Le popolazioni di memoria in OR e IN vie di inoculazione dimostrano il maggiore potenziale di proliferazione e IFN-γ produzione post-sfida.

Eventuali brevetti o pubblicazioni menzionate in questa specifica sono qui incorporati per riferimento nella stessa misura, come se ogni singola pubblicazione è specificamente e individualmente indicato per essere incorporato per riferimento.

Le composizioni ed i metodi qui descritti sono attualmente rappresentante di forme di realizzazione preferite, esemplare, e non inteso come limiti alla portata dell'invenzione. Modifiche ivi e altri usi avverrà agli esperti del ramo. Tali modifiche e altri usi possono essere apportate senza uscire dall'ambito della dell'invenzione espresso dalle rivendicazioni. Tutti i campi numerici sono comprensivi di tutto interi e decimali tra gli endpoint, e comprensivo degli endpoint.

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Citazioni brevetti

Brevetto Citata	Data di deposito	Data di pubblicazione	Richiedente	Titolo
US20010053519 *	Mar 6, 2000	20 Dicembre 2001	Fodor Stephen PA	Sequenze nucleotidiche da utilizzare come strumento di ingegneria genetica
WO2009128867A2*	7 gennaio 2009	22 ott 2009	Warf - Wisconsin Alumni Research Foundation	Ricombinante contenuta biologicamente filovirus

* Citato da esaminatore

Citazioni Non-brevetti

Riferimento
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8	*	Warfield et al (Journal of Infectious Diseases 196: S276-283, 15 novembre, 2007),

* Citato da esaminatore

Classificazioni


US Classificazione	424/93.6 , 530/325 , 435/236 , 530/330 , 530/327 , 435/235.1 , 530/350 , 530/328 ,514/1.1 , 530/324 , 514/44.00R , 536/23.72 , 530/326 , 530/329
Classificazione internazionale	A61K38 / 02 , A61K31 / 7088 , C07H21 / 04 , C07K7 / 06 , C12N7 / 04 , A61K35 / 76 , C07H21 / 02 , C12N7 / 00 , C07K14 / 08 , C07K7 / 08
Cooperativa Classificazione	C07K16/10 , G01N33/56983 , C12N7/00 , C12N2760/14145 , C07K2316/96 ,C12N2810/6072 , C12N2760/14143 , A61K39/12 , A61K2039/53 ,A61K2039/5256 , G01N2333/08
Classificazione europea	A61K39 / 12, C07K16 / 10, G01N33 / 569K, C12N7 / 00

Eventi legali

Data	Codice	Evento	Descrizione
Apr 25, 2011	AS	Assegnazione	Nome Proprietario: IL GOVERNO DEGLI STATI UNITI D'AMERICA COME Libera formato testo: ASSEGNAZIONE DI INTERESSE cedenti; cedenti: Towner, Jonathan S.; Nichol, STUART T., COMER, James A., e altri; DATE FIRMA DA 20110415 A 20110425; REEL / TELAIO: 026177/0586

domenica 21 settembre 2014

Ebola Virus brevettato dal governo degli Stati Uniti nel mese di ottobre 2009: "un'invenzione relativa a nuove specie di Ebola (hEbola) virus umano" Global Research, 20 settembre 2014 Google (Brevetti)

Ebola Virus brevettato dal governo degli Stati Uniti nel mese di ottobre 2009: "un'invenzione relativa a nuove specie di Ebola (hEbola) virus umano"

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